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文檔簡介
1、實驗?zāi)康模貉芯扛骨蛔⑸?、灌胃、皮膚染毒丙烯酰胺(AA)對小鼠睪丸細(xì)胞損傷的影響;建立AA染毒小鼠模型,研究AA致雄性小鼠睪丸細(xì)胞凋亡作用及對波形蛋白表達(dá)的影響,進(jìn)而研究波形蛋白表達(dá)與生精細(xì)胞凋亡的關(guān)系;探討AA致雄性生殖毒性作用的靶細(xì)胞,為AA生殖毒性機(jī)制研究提供實驗室依據(jù)。
實驗內(nèi)容與方法:
第一部分將48只5周齡清潔級健康雄性昆明種小鼠隨機(jī)分為4組,分別為空白對照組、腹腔染毒組、灌胃染毒組和皮膚染毒組,每
2、組12只。染毒劑量為25mg/kg,連續(xù)染毒5d,每天1次。觀察染毒前后體重變化和睪丸系數(shù)。于首次染毒后第6天行單細(xì)胞凝膠電泳實驗,第19天行睪丸早期精細(xì)胞微核實驗。
第二部分將7~8周齡40只清潔級健康雄性昆明種小鼠隨機(jī)分為4組,每組10只。用不同劑量的AA(0、10、20、40mg/kg)對小鼠連續(xù)灌胃5w,每周6天,其中0mg/kg給予等體積蒸餾水,即正常對照組。于首次染毒AA后第36天處死小鼠,采用組織病理學(xué)技術(shù)(
3、HE染色),流式細(xì)胞術(shù)(FCM),TUNEL法,免疫組織化學(xué)法,RT-PCR技術(shù),分別從組織學(xué)水平,細(xì)胞水平,DNA水平,蛋白水平及mRNA水平,分析AA致睪丸細(xì)胞凋亡及其與波形蛋白表達(dá)的關(guān)系。
實驗結(jié)果:
1.腹腔染毒組和灌胃染毒組小鼠體重均顯著減少(P<0.01)。三種染毒方式小鼠的睪丸重量及睪丸系數(shù)均較對照組明顯降低(P<0.05或P<0.01)。與空白對照組比較,各染毒組小鼠單細(xì)胞凝膠電泳結(jié)果:睪丸細(xì)
4、胞DNA的尾長、尾部DNA%、尾矩、Olive尾矩均較高,差異均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05或P<0.01)。
2.三種染毒方式小鼠體重和睪丸重量均明顯小于空白對照組(P<0.05或P<0.01)。而與空白對照組比較,睪丸系數(shù)差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。灌胃染毒組早期精細(xì)胞微核率顯著高于空白對照組(P<0.05),而腹腔染毒組和皮膚染毒組早期精細(xì)胞微核率雖高于空白對照組,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
5、 3.HE染色結(jié)果顯示:10mg/kg組與正常對照組比較,小鼠睪丸曲細(xì)精管排列基本規(guī)則,各級生精細(xì)胞未見明顯改變。20mg/kg和40mg/kg劑量組小鼠,曲細(xì)精管排列不規(guī)則,生精上皮層次減少,各級生精細(xì)胞減少,管腔內(nèi)成熟精子減少,且有空泡形成。
4.FCM結(jié)果顯示,與對照組相比,各劑量染毒組的1C細(xì)胞明顯減少,2C細(xì)胞的比例顯著提高(P<0.01),且10mg/kg和20mg/kg劑量組1C和2C細(xì)胞的比例差異無統(tǒng)計
6、學(xué)意義(P>0.05)。10mg/kg和20mg/kg劑量組4C細(xì)胞的比例較對照組增加,40mg/kg組4C細(xì)胞的比例低于前兩組,但仍高于對照組,且均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。各染毒組1C∶4C,及1C∶2C均明顯低于對照組(P<0.01),但各染毒組兩兩比較,均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。4C∶2C僅在40mg/kg劑量組與對照組比較減少有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。
5.TUNEL法的檢測結(jié)果表明,各劑量組的細(xì)胞
7、凋亡指數(shù)顯著高于正常對照組(P<0.05)。
6.免疫組化結(jié)果顯示,20mg/kg組和40mg/kg組波形蛋白表達(dá)的平均光密度值較正常對照組明顯減少(P<0.05),10mg/kg較正常對照組減少但無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。
7.RT-PCR結(jié)果表明與正常對照組比較,各劑量組小鼠睪丸波形蛋白mRNA表達(dá)均明顯降低(P<0.05)。
結(jié)論1.在本實驗條件下,三種方式染毒AA均可致雄性小鼠睪丸細(xì)
8、胞產(chǎn)生DNA損傷,使小鼠睪丸早期精細(xì)胞微核發(fā)生率升高,且以灌胃染毒方式產(chǎn)生的毒性作用最為敏感;2.AA誘導(dǎo)可使小鼠睪丸曲細(xì)精管各級生精細(xì)胞減少,管腔內(nèi)成熟精子減少。3.AA可以降低精原細(xì)胞轉(zhuǎn)化為精子的效能,使精子細(xì)胞和精子數(shù)量減少,使生精過程發(fā)生障礙。其致細(xì)胞凋亡作用的靶細(xì)胞可能是精原細(xì)胞。4.AA誘導(dǎo)可使生精上皮凋亡指數(shù)增加,且有劑量依賴性。5.AA使得波形蛋白及mRNA的表達(dá)顯著減少,且主要是間質(zhì)細(xì)胞中的波形蛋白表達(dá)減少。推測AA生
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