凝血因子XⅢ自身抗體致獲得性FXⅢ缺乏癥的臨床特點(diǎn)、IgG亞型及FXⅢ結(jié)合表位研究.pdf

1、研究背景：由凝血因子XⅢ(coagulation factor ⅩⅢ FⅩⅢ)抑制物引起的FⅩⅢ缺乏是一種十分少見的出血性疾病，目前國際上有正式文獻(xiàn)報(bào)道的病例僅34例。該病發(fā)病年齡較大，無男女性別差異。FⅩⅢ抑制物通過中和FⅩⅢ的活性，導(dǎo)致纖維蛋白單體間交聯(lián)異常，使患者血漿纖維蛋白凝塊不穩(wěn)定，從而出現(xiàn)嚴(yán)重的反復(fù)自發(fā)性出血，出血部位廣泛，常表現(xiàn)為皮膚粘膜瘀斑、軟組織及肌肉血腫、內(nèi)臟出血、術(shù)后延遲性出血甚至顱內(nèi)出血等，該病出血癥狀重，治療困

2、難，死亡率接近50％。FⅩⅢ抑制物產(chǎn)生原因不明，已有的研究結(jié)果提示可能與自體免疫紊亂有關(guān)。一些自身免疫性疾病(如系統(tǒng)紅斑狼瘡)或長期應(yīng)用某種藥物(如異煙肼、青霉素等)可導(dǎo)致產(chǎn)生FⅩⅢ抑制物，1％的遺傳性FⅩⅢ患者在接受FⅩⅢ濃縮物替代治療后可產(chǎn)生FⅩⅢ抑制物。亦有部分FⅩⅢ抑制物在正常人體內(nèi)自發(fā)產(chǎn)生。目前報(bào)道的FⅩⅢ抑制物絕大部分為多克隆或單克隆IgG，以IgG1優(yōu)勢(shì)表達(dá)為主，可作用于纖維蛋白多聚體形成過程中的各個(gè)環(huán)節(jié)。根據(jù)FⅩⅢ抑制物

3、作用位點(diǎn)不同可將其分為三種類型，Ⅰ型FⅩⅢ抑制物直接抑制FⅩⅢ的活化，Ⅱ型FⅩⅢ抑制物影響FⅩⅢa(activated factor ⅩⅢ FⅩⅢa)的轉(zhuǎn)氨酶活性，Ⅲ型FⅩⅢ抑制物阻斷FⅩⅢa與纖維蛋白底物反應(yīng)。FⅩⅢ A亞單位為功能亞單位，分為激活肽(含有凝血酶結(jié)合位點(diǎn))、B夾心區(qū)、核心區(qū)(含有Ca<'2+>結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)氨酶活性位點(diǎn))、折疊桶狀區(qū)1、折疊桶狀區(qū)2等五個(gè)結(jié)構(gòu)域，有關(guān)FⅩⅢ抑制物作用于FⅩⅢ A亞單位的具體結(jié)構(gòu)表位尚不清楚

4、。我們最近3年診斷了國際上首例繼發(fā)于意義未明的單克隆丙種球蛋白血癥的FⅩⅢ抑制物和國際上第3例繼發(fā)于系統(tǒng)性紅斑狼瘡的FⅩⅢ抑制物，分別對(duì)其臨床特點(diǎn)、免疫學(xué)特性及發(fā)病機(jī)理進(jìn)行了深入研究。 第一部分凝血因子ⅩⅢ抑制物致獲得性凝血因子ⅩⅢ缺乏的臨床特點(diǎn)、診斷和治療。 目的：分析FⅩⅢ抑制物致獲得性FⅩⅢ缺乏患者的臨床及實(shí)驗(yàn)室特點(diǎn)，確定診斷，以加深對(duì)獲得性FⅩⅢ抑制物引起出血的臨床特點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)的認(rèn)識(shí)，提高對(duì)該病的診斷水平及治

5、療緩解率。 方法：①對(duì)2例患者的臨床出血表現(xiàn)、出血部位、出血史、家族史及原發(fā)病病史進(jìn)行詳細(xì)采集與分析；②進(jìn)行活化部分凝血活酶時(shí)間(AFTT)、凝血酶原時(shí)間(PT)、凝血酶時(shí)間(TT)、纖維蛋白原(FIB)、D-二聚體(D-D)、血小板聚集功能等實(shí)驗(yàn)室檢查；用尿素溶解試驗(yàn)及其糾正試驗(yàn)證實(shí)FⅩⅢ抑制物的存在；利用western blot結(jié)合蛋白條帶灰度掃描確定患者體內(nèi)FⅩⅢ含量；③用免疫抑制劑及新鮮冷凍血漿輸注，觀察患者臨床癥狀的改

6、善情況，以判斷臨床治療效果。 結(jié)果：①兩位患者的臨床表現(xiàn)均符合FⅩⅢ缺乏的臨床特點(diǎn)，病例1患者此次起病前曾患意義未明的單克隆球蛋白血癥，病例2患者起病前曾患系統(tǒng)性紅斑狼瘡，此后均出現(xiàn)不明原因的多部位出血。既往無出血史及出血家族史，故出血性疾病顯然為獲得性因素所致。②凝血機(jī)制實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果：兩位患者 PT、APTT、TT、FIB、D-D、血小板計(jì)數(shù)和聚集功能均正常；尿素溶解試驗(yàn)結(jié)果示兩位患者血漿凝塊置入5M尿素溶液內(nèi)后均在24小時(shí)

7、內(nèi)出現(xiàn)溶解(正常對(duì)照在48小時(shí)后仍未溶解)，加入正常血漿均不能糾正；western印跡結(jié)合灰度掃描分析顯示病例1患者血漿FⅩⅢ濃度為2.9mg/L，病例2患者血漿FⅩⅢ濃度低至檢測(cè)不到的水平(正常對(duì)照為31mg/L)。③用皮質(zhì)激素結(jié)合環(huán)磷酰胺及輸注新鮮冷凍血漿治療后，兩位患者出血癥狀明顯緩解，病例2患者出院后口服強(qiáng)的松加環(huán)磷酰胺，至今未再出現(xiàn)出血癥狀。 結(jié)論：①分別診斷了意義未明的單克隆丙種球蛋白血癥并獲得性FⅩⅢ抑制物及系統(tǒng)性

8、紅斑狼瘡并FⅩⅢ抑制物兩例患者；尿素溶解試驗(yàn)可作為此出血性疾病的初篩試驗(yàn)，進(jìn)一步的尿素溶解糾正試驗(yàn)、FⅩⅢ定量測(cè)定可確定獲得性FⅩⅢ抑制物的診斷；②免疫抑制劑及輸注新鮮冷凍血漿對(duì)控制FⅩⅢ抑制物致獲得性FⅩⅢ缺乏患者出血癥狀有效。 第二部分獲得性凝血因子ⅩⅢ抑制物對(duì)正常血漿凝血因子ⅩⅢ活性及纖維蛋白交聯(lián)的抑制作用。 目的：純化患者及正常人血漿IgG；證明患者體內(nèi)FⅩⅢ抑制物對(duì)正常人血漿FⅩⅢ活性的影響程度及對(duì)纖維蛋白交聯(lián)

9、的抑制作用；從纖維蛋白結(jié)構(gòu)的微觀角度探討FⅩⅢ抑制物對(duì)纖維蛋白凝塊結(jié)構(gòu)強(qiáng)度的影響。 方法：①用蛋白A-瓊脂糖柱分離純化患者及正常人血漿IgG；SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)及非變性凝膠電泳(native-PAGE)鑒定IgG分子量大小和回收純化的血漿IgG組分；②分別將純化的兩位患者IgG、輕鏈及正常人IgG以不同濃度(0mg/ml、1.38 mg/ml、2.76mg/ml)加入正常人混合血漿中，進(jìn)行尿素溶解試驗(yàn)

10、以分析其對(duì)正常人血漿FⅩⅢ活性的抑制作用；③SDS-PAGE分析兩位患者及正常人血漿纖維蛋白凝塊中纖維蛋白原各單體的交聯(lián)；同時(shí)分別將純化的兩位患者IgG加入正常人混合血漿中(終濃度為2.76mg/ml)，SDS-PAGE分析患者IgG對(duì)正常血漿纖維蛋白交聯(lián)的抑制作用；④應(yīng)用掃描電鏡分析患者及正常人血漿纖維蛋白凝塊微觀結(jié)構(gòu)上的差異。 結(jié)果：①分別獲得了純化的患者及正常人IgG和病例1患者血漿輕鏈蛋白；②加入病例1患者或病例2患者純

11、化的IgG后，可使正?；旌涎獫{纖維蛋白凝塊在5M尿素溶液中24小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)部分溶解，且溶解程度呈IgG濃度依賴性；而加入正常人純化的IgG或回收純化的病例1患者血漿輕鏈對(duì)血漿纖維蛋白凝塊的尿素溶解無影響；③病例1患者血漿纖維蛋白凝塊中纖維蛋白單體部分交聯(lián)成a<,n>多聚體和γ-γ二聚體，有部分γ單體存在，病例2患者血漿纖維蛋白凝塊中纖維蛋白單體則完全無交聯(lián)；病例1患者IgG可部分抑制正常血漿中a、γ纖維蛋白單體的交聯(lián)，病例2患者IgG可完

12、全抑制正常血漿中a、γ纖維蛋白單體的交聯(lián)，而正常人IgG對(duì)血漿纖維蛋白的交聯(lián)無影響；④電鏡下可見正常人血漿纖維蛋白凝塊由結(jié)構(gòu)致密的纖維蛋白絲組成，纖維蛋白絲較粗，無“網(wǎng)孔”形成；而病例2患者血漿纖維蛋白凝塊結(jié)構(gòu)松散，纖維蛋白絲較細(xì)，凝塊表面有較大的“網(wǎng)孔”形成；病例1患者血漿纖維蛋白凝塊結(jié)構(gòu)介于正常人和病例2之間。 結(jié)論：兩位患者血漿IgG在體外可明顯中和FⅩⅢ活性，抑制纖維蛋白單體a、γ鏈的交聯(lián)，患者纖維蛋白凝塊微觀結(jié)構(gòu)疏松、

13、纖維蛋白絲較細(xì)，形成大小不等的“網(wǎng)孔”樣外觀，與正常纖維蛋白凝塊存在明顯差異，說明抑制物引起的FⅩⅢ缺乏或活性喪失，F(xiàn)ⅩⅢ對(duì)纖維蛋白的穩(wěn)定效應(yīng)明顯削弱，導(dǎo)致臨床上的出血癥狀。 第三部分獲得性凝血因子ⅩⅢ抑制物IgG亞型分析及作用于凝血因子ⅩⅢ的表位研究。 目的：鑒定FⅩⅢ抑制物的IgG亞型；確定患者FⅩⅢ抑制物作用于FⅩⅢ的結(jié)構(gòu)性表位，揭示該病發(fā)病的分子機(jī)制。 方法：①FⅩⅢ/FⅩⅢ抑制物固相結(jié)合試驗(yàn)結(jié)合West

14、ern印跡技術(shù)，鑒定FⅩⅢ抑制物的免疫亞型；②SDS-PAGE分析患者IgG對(duì)凝血酶活化FⅩⅢ的抑制作用；③人工合成FⅩⅢA亞單位功能結(jié)構(gòu)域的多肽，采用dot印跡分析患者IgG對(duì)FⅩⅢ功能結(jié)構(gòu)域作用與否。 結(jié)果：①FⅩⅢ/FⅩⅢ抑制物固相結(jié)合后行western印跡結(jié)果顯示，當(dāng)以病例2患者血漿孵育PVDF膜過夜后，鼠抗人IgG<,1>、IgG<,4>抗體檢測(cè)在FⅩⅢA亞單位處存在陽性信號(hào)，鼠抗人IgG<,2>、IgG<,3>抗體檢

15、測(cè)無信號(hào)；以病例1患者血漿孵育PVDF膜過夜后，鼠抗人IgG<,1>抗體檢測(cè)在A亞單位處存在陽性信號(hào)，鼠抗人IgG<,2>、IgG<,3>、IgG<,4> 抗體檢測(cè)無信號(hào)；②用在凝血酶作用于純化的人FⅩⅢ蛋白，SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，F(xiàn)ⅩⅢ由原來分子量不同的A亞單位和B亞單位(兩條帶)變?yōu)榉肿恿肯嘟腁′亞單位和B亞單位(一條帶)，加入病例2患者IgG后，蛋白條帶為A′亞單位和B亞單位，而加入病例1患者IgG共孵育后，蛋白條帶仍為

16、A亞單位和B亞單位；③合成了FⅩⅢ A亞單位含有鈣離子(Ca<'2+>)結(jié)合位點(diǎn)的多肽片斷NH2-YKFQEGQEEE-CONH2(下稱多肽<,Ca2+>)和含有轉(zhuǎn)氨酶活性位點(diǎn)的多肽片斷NH2-GWQAVDSTPQ-CONH2(下稱多肽<,active>)，將其分別進(jìn)行FⅩⅢ/FⅩⅢ抑制物固相結(jié)合及dot印跡分析，以兔抗人IgG二抗進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示以病例2患者血漿孵育過夜的PVDF膜在FⅩⅢ、多肽<,Ca2+>和多肽<,active>

17、點(diǎn)樣處均存在陽性信號(hào)，而以病例1患者血漿孵育過夜的PVDF膜在FⅩⅢ點(diǎn)樣處存在陽性信號(hào)，在多肽<,Ca2+>和多肽<,active>點(diǎn)樣處不存在陽性信號(hào)；而以正常人血漿孵育過夜的PVDF膜在FⅩⅢ、多肽<,Ca2+>和多肽<,active>點(diǎn)樣處均不顯示蛋白信號(hào)。 結(jié)論：①意義未明的單克隆丙種球蛋白血癥并獲得性FⅩⅢ抑制物IgG亞型為IgG<,1>，系統(tǒng)性紅斑狼瘡并FⅩⅢ抑制物IgG亞型為IgG<,1>和IgG<,4>；②病例1