版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡(jiǎn)介
1、研究目的和內(nèi)容:通過比較FMR1 KO鼠和WT鼠海馬GAD、GABAAR α5表達(dá)的改變,了解GABA能神經(jīng)元數(shù)量和結(jié)構(gòu)變化是否為FMR1 KO鼠癲癇易感的基礎(chǔ)。通過比較FMR1 KO鼠和WT鼠海馬組織以及GABA 能神經(jīng)元NaV1.1蛋白表達(dá)的改變,探討NaV1.1對(duì)FMR1 KO鼠神經(jīng)元鈉電流可能的影響。通過檢測(cè)FMR1 KO鼠和WT鼠海馬中間神經(jīng)元和錐體神經(jīng)元鈉電流的電生理學(xué)變化,從而進(jìn)一步在功能上探討抑制性神經(jīng)元興奮性改變?cè)贔M
2、R1 KO鼠癲癇形成中的作用。
研究方法:
1.FMR1基因敲除鼠模型的鑒定
FVB品系小鼠飼養(yǎng)在19~21 ℃自然光條件下,自由獲取食物和水分。選取14-17 天齡的FMR1 KO鼠和WT 鼠,一般選取雄性小鼠,實(shí)驗(yàn)前取尾提取DNA,PCR技術(shù)進(jìn)行基因型鑒定。
2.熒光實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)
目標(biāo)基因的表達(dá)量在解剖顯微鏡下分離海馬組織。在玻璃勻漿器中加入海馬腦組織
3、和RNAisoReagent Trizol 研磨,提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄cDNA 后進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)GAD、GABAAR α5、NaV1.1和內(nèi)參GAPDH的mRNA,并進(jìn)行相對(duì)定量分析。
3.Western blotting檢測(cè)
目標(biāo)蛋白表達(dá)水平同上方法分離海馬組織,提取蛋白后檢測(cè)蛋白濃度,進(jìn)行Western blotting。電泳轉(zhuǎn)膜后分別使用GAD、GABAAR α5、NaV1.1和內(nèi)參β
4、-actin的抗體孵育,然后孵育相應(yīng)二抗,曝光顯影后對(duì)條帶進(jìn)行定量分析。
4.免疫組化和免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)
目標(biāo)蛋白共表達(dá)水平多聚甲醛灌注小鼠,冰凍切片,做GAD細(xì)胞免疫組化,統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)目,并孵育GAD和NaV1.1的抗體以及相應(yīng)二抗,在熒光顯微鏡下觀察,GAD 神經(jīng)元和NaV1.1 共表達(dá)分析。
5.膜片鉗檢測(cè)
鈉電流特征急性分離海馬神經(jīng)元,分別選取中間神經(jīng)元和錐體神經(jīng)元,在全細(xì)胞
5、電壓鉗模式下給予標(biāo)準(zhǔn)刺激方案,根據(jù)所得電流數(shù)據(jù)建立快速鈉電流的激活曲線、失活曲線和失活后復(fù)活曲線,計(jì)算持續(xù)鈉電流的最大波幅,激活電壓和電流密度等進(jìn)行比較。
6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,統(tǒng)計(jì)方法用SPSSl6.0 for Windows軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用t 檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義
研究結(jié)果:
1.FMR1 KO鼠和WT鼠海馬GABA能神
6、經(jīng)元數(shù)目和GAD表達(dá)的變化
FMR1 KO鼠和WT鼠海馬GABA能神經(jīng)元數(shù)目的比較:FMR1 KO鼠海馬GABA 能神經(jīng)元80±20.134,WT 鼠95.11±14.186,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.007);CA1 區(qū)FMR1 KO鼠32.24±7.710,WT 鼠39.59±6.738,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002);CA3 區(qū)FMR1 KO鼠29.94±10.028,WT 鼠35.07±6.324 差異具有
7、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.043);DG 區(qū)FMR1 KO鼠17.82±5.703,WT 鼠20.44±3.545,差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.066);在mRNA水平的比較:FMR1 KO鼠GAD67表達(dá)高于WT 鼠,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.006)。FMR1 KO鼠和WT 鼠海馬GAD蛋白水平的比較:FMR1 KO鼠GAD67和GAD65的表達(dá)均高于WT 鼠,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000);在mRNA水平的比較:FMR1 KO
8、鼠GAD67表達(dá)高于WT 鼠,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.006)。
2.FMR1 KO鼠和WT鼠海馬GABAAR α5表達(dá)的變化
FMR1 KO鼠和WT鼠海馬GABAAR α5蛋白水平的比較:FMR1 KO鼠GABAAR α5的表達(dá)低于WT 鼠,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000);在mRNA水平的比較:FMR1KO鼠GABAAR α5表達(dá)低于WT 鼠,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.031)。
9、3.FMR1 KO鼠和WT鼠海馬NaV1.1表達(dá)的變化
FMR1 KO鼠和WT 鼠海馬NaV1.1 蛋白水平的比較:FMR1 KO鼠Nav1.1的表達(dá)高于WT 鼠,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000);在mRNA水平的比較:FMR1 KO鼠Nav1.1的表達(dá)高于WT 鼠,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。
4.FMR1 KO鼠和WT鼠海馬神經(jīng)元GAD和NaV1.1共表達(dá)
Nav1.1通道蛋白
10、在海馬區(qū)的神經(jīng)元均有表達(dá):錐體層的錐體神經(jīng)元和齒狀回顆粒層的顆粒細(xì)胞胞體(未被GAD 標(biāo)記)上的表達(dá)較弱,NaV1.1 蛋白在錐體層和顆粒層中散在分布的GAD 標(biāo)記的神經(jīng)元上卻有著比較強(qiáng)的陽(yáng)性表達(dá)。
5.海馬鈉通道電生理特性
5.1.鈉通道的激活FMR1 KO鼠和WT 鼠錐體神經(jīng)元V0.5與k 值分別為:FMR1 KO鼠(n=4):-34.56±2.23(mV),4.43±0.35;WT(n=4):-37.8
11、7±2.18(mV),4.69±0.41,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);FMR1 KO鼠和WT 鼠中間神經(jīng)元:FMR1 KO鼠(n=4):-32.07±2.06(mV),4.38±1.11;WT(n=4):-32.56±1.68(mV),5.02±0.4,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
結(jié)論:
1.本研究首次發(fā)現(xiàn)FMR1 KO鼠海馬GABA 能神經(jīng)元數(shù)目降低,其抑制性降低可能是導(dǎo)致FMR1 KO鼠癲癇
12、易感性增高的原因之一,也為進(jìn)一步研究提供了形態(tài)學(xué)的基礎(chǔ)。
2.本研究首次發(fā)現(xiàn)FMR1 KO鼠海馬GABAAR α5蛋白表達(dá)減少,提示其介導(dǎo)的中間神經(jīng)元抑制性降低可能是導(dǎo)致FMR1 KO鼠癲癇易感性增高的原因之一。
3.本研究首次在FMR1基因敲除小鼠海馬組織發(fā)現(xiàn)電壓門控鈉離子通道a 亞單位NaVl.1表達(dá)水平增高;進(jìn)一步的電生理研究發(fā)現(xiàn)FMR1 KO鼠錐體神經(jīng)元鈉通道興奮性的增強(qiáng),中間神經(jīng)元鈉通道興奮性降低。
13、為FMR1 KO鼠癲癇易感性增高提供了電生理依據(jù)。不僅說明NaVl.1表達(dá)的增高可能所致是錐體神經(jīng)元鈉通道興奮性增強(qiáng)的原因,而且為中間神經(jīng)元抑制性降低導(dǎo)致FMR1 KO鼠癲癇易感性增高提供了電生理依據(jù)。在細(xì)胞水平中間神經(jīng)元鈉通道興奮性降低的原因NaVl.1的表達(dá)情況及其與電生理的關(guān)系待進(jìn)一步研究。
4.本研究顯示FMR1基因敲除小鼠海馬組織GAD和NaVl.1mRNA和蛋白在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平表達(dá)均增高,支持FMRP 具有負(fù)性
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁(yè)內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫(kù)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- FMR1基因敲除鼠腦組織GABA能中間神經(jīng)元的改變.pdf
- Fmr1敲除鼠海馬Fast-spiking中間神經(jīng)元鉀離子通道特性分析.pdf
- NRG1-ErbB4信號(hào)在Fmr1基因敲除鼠腦組織中的改變及意義.pdf
- FMR1基因敲除小鼠腦組織中SPAR的表達(dá).pdf
- mGluR5拮抗劑MPEP對(duì)FMR1基因敲除小鼠神經(jīng)元樹突棘的影響及機(jī)制探討.pdf
- GSK-3β、mTOR在Fmr1基因敲除小鼠脊髓水平的痛覺調(diào)制中的作用.pdf
- GABA能抑制在豚鼠下丘神經(jīng)元間隔探測(cè)中的作用.pdf
- FMR1基因敲除對(duì)雄性小鼠生殖功能的影響.pdf
- GABA能回路系統(tǒng)在DRG神經(jīng)元中的表達(dá).pdf
- 鉀通道功能調(diào)節(jié)參與1型代謝性谷氨酸受體介導(dǎo)的Fmr1基因敲除小鼠神經(jīng)元興奮性改變.pdf
- FMR1基因敲除小鼠聽源性癲癇的生化機(jī)制及其柴胡桂枝湯揮發(fā)油的干預(yù)作用.pdf
- 神經(jīng)元發(fā)放的信息熵編碼及其在癲癇發(fā)病機(jī)制研究中的應(yīng)用.pdf
- 柴胡桂枝湯揮發(fā)油對(duì)Fmr1基因敲除小鼠的治療作用和機(jī)制探討.pdf
- GABA受體激活對(duì)海人藻酸誘導(dǎo)的癲癇模型中神經(jīng)元損傷的作用及分子機(jī)制研究.pdf
- AKT-ERK-GAP43通路在Fmr1基因敲除小鼠海馬中的改變.pdf
- 癲癇大鼠海馬GABA能中間神經(jīng)元的動(dòng)態(tài)變化及突觸重建研究.pdf
- 相關(guān)調(diào)控基因在谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷和癲癇發(fā)病機(jī)制中的實(shí)驗(yàn)研究.pdf
- DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因CSB-PGBD3、MSH5和FMR1在卵巢早衰發(fā)病中的作用機(jī)制研究.pdf
- 神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)在癲癇發(fā)病機(jī)制中的作用及其基因表達(dá)變化.pdf
- FMR1基因的可變剪接及其意義.pdf
評(píng)論
0/150
提交評(píng)論