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文檔簡(jiǎn)介
1、松褐天牛Monochamus alternatus Hope為害松樹(shù),影響植株正常生長(zhǎng),同時(shí)是傳播松材線蟲(chóng)病的國(guó)際檢疫性害蟲(chóng),給我國(guó)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。松褐天?;顒?dòng)具有隱蔽性,化學(xué)防治、物理防治和生物防治的單一使用難以在較短時(shí)間內(nèi)控制松褐天牛,因此,急需尋找一種環(huán)保高效措施防治松褐天牛。昆蟲(chóng)嗅覺(jué)在其尋找寄主植物取食和產(chǎn)卵交配場(chǎng)所起到重要作用,萜烯類揮發(fā)物對(duì)松褐天牛有一定的引誘效果,但對(duì)于松褐天牛成蟲(chóng)如何感知這些信息化學(xué)物質(zhì)的機(jī)制還不明確。
2、氣味結(jié)合蛋白(OBPs)在昆蟲(chóng)嗅覺(jué)系統(tǒng)實(shí)行氣味感知和運(yùn)輸過(guò)程中起著極其重要的作用,但對(duì)于OBPs在昆蟲(chóng)嗅覺(jué)中的功能還不明確。為此,本課題以松褐天牛為研究對(duì)象,在克隆了其觸角9條MaltOBPs基因的基礎(chǔ)上,分析MaltOBPs基因時(shí)空表達(dá)譜,測(cè)定MaltOBPs與寄主植物松樹(shù)揮發(fā)物的結(jié)合特性,并分析松褐天牛成蟲(chóng)對(duì)氣味物質(zhì)的行為反應(yīng),以期為闡明MaltOBPs在松褐天牛嗅覺(jué)感受中的功能奠定基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下:
1.松褐天牛氣味結(jié)
3、合蛋白(MaltOBPs)基因克隆
克隆了松褐天牛9條MaltOBPs基因全長(zhǎng),MaltOBP6、MaltOBP7、MaltOBP12、MaltOBP13、MaltOBP14、MaltOBP15、MaltOBP16、MaltOBP18、MaltOBP20。9條MaltOBPs基因分別編碼143、128、143、136、166、133、142、124、131個(gè)氨基酸,GenBank登錄號(hào)分別為KF977559、KF977560、
4、KF977565、KF977566、KF977567,KF977568、KF977569、KF977571、KF977573。通過(guò)氨基酸序列分析,5條OBPs基因MaltOBP6、MaltOBP13、MaltOBP14、MaltOBP15、MaltOBP16具有6個(gè)保守的半胱氨酸,屬于Classic OBPs;而MaltOBP7、MaltOBP12、MaltOBP18、MaltOBP20具有四個(gè)保守的半胱氨酸,屬于Minus-C OBP
5、s。
2.松褐天牛OBPs基因時(shí)空表達(dá)特性
通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了MaltOBP6、MaltOBP7、MaltOBP12、MaltOBP13、MaltOBP14、MaltOBP15、MaltOBP16、MaltOBP18、MaltOBP20等9條基因在不同時(shí)期、不同組織的表達(dá)情況。結(jié)果表明,9條MaltOBPs主要表達(dá)于觸角和腹末三節(jié),也有基因高表達(dá)于足中,且在頭、翅也有一定的表達(dá)量;而松褐天牛9條MaltOB
6、Ps基因在觸角中表達(dá)量受交配狀態(tài)、性別、發(fā)育時(shí)期而呈現(xiàn)差異。
3.松褐天牛MaltOBP13表達(dá)純化及結(jié)合特性
構(gòu)建pET30a-MaltOBP13重組質(zhì)粒,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21(DE3)中試表達(dá)成功,主要表達(dá)于包涵體中,通過(guò)包涵體變性和復(fù)性獲得帶有部分雜蛋白的融合蛋白液,由Ni sepharose high performanc的1ml預(yù)裝柱純化和recombinant bovineenterokinase酶切,
7、獲得MaltOBP13純蛋白。
以1-NPN為熒光探針進(jìn)行熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn),測(cè)定該蛋白與20種松樹(shù)揮發(fā)物在酸性(pH=5.0)和中性(pH=7.4)條件下的結(jié)合特性。結(jié)果表明,MaltOBP13在酸性條件下與松樹(shù)揮發(fā)物有較好的結(jié)合能力,在中性和酸性條件下與大部分單體物質(zhì)有較好的結(jié)合特性。
4.松褐天牛成蟲(chóng)對(duì)氣味物質(zhì)的行為選擇
依據(jù)實(shí)驗(yàn)室已有松樹(shù)揮發(fā)物單體,結(jié)合MaltOBP13在中性條件下與揮發(fā)物結(jié)合力的反
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