松褐天牛OBPs基因克隆與分析.pdf

1、松材線蟲Bursaphelenchusxylophilus(SteinerandBuhrer)Nickle(Nematoda:Aphelenchoididae)是松樹重要的病原，導致松樹死亡，造成嚴重的生態(tài)及經(jīng)濟損失。松褐天牛MonochamusalternatusHope是松材線蟲病在中國的主要傳播媒介，控制松褐天牛是防治松材線蟲病的主要手段。松褐天牛屬蛀干性害蟲，幼蟲生活隱蔽，傳統(tǒng)的防治方法難以奏效，目前利用引誘劑進行防治也有進展，

2、但也存在一定問題。為此，如果能夠明確其嗅覺感受的機制將對治理該害蟲具有重要的借鑒意義。昆蟲嗅覺在其寄主定位、尋找配偶中起著重要的作用，目前普遍認為氣味結合蛋白OdorantBindingproteins(OBPs)在結合氣味分子并轉(zhuǎn)運到氣味受體起到重要作用，但對于其具體的功能還不清晰。為此，本研究以松褐天牛為研究對象，在構建其觸角cDNA文庫的基礎上，克隆其OBPs基因，并在原核表達的基礎上，測定OBPs與氣味物質(zhì)的結合特性，以期為結合

3、氣味分子提供理論基礎。主要結果如下:
　　1、松褐天牛觸角cDNA文庫的構建
　　成功構建松褐天牛觸角cDNA文庫，挑取2052個單克隆進行測序，經(jīng)過去冗余拼接的到1133條Unigenes，其中多拷貝contigs有276個，單拷貝singlets有857個。通過預測開放閱讀框，計算得到松褐天牛觸角cDNA文庫GC含量為41.8％。通過與COG功能比對350條Unigenes被分到了21個功能類群。通過BLASTx比對從松

4、褐天牛觸角cDNA文庫發(fā)現(xiàn)了4個OBPs基因和一個化學感受蛋白ChemosensoryProtein(CSP)基因，為研究松褐天牛分子生物學奠定基礎。
　　2、松褐天牛OBPs的克隆及序列分析
　　通過PCR技術克隆得到了4個OBPs基因的全長，MaltOBP2、MaltOBP3、MaltOBP4和MaltOBP5(GenBank登錄號分別為:KF460431、KF460432、KF460433和KF460434)開放閱讀框

5、分別為402、408、423和378bp，編碼133、135、142和125個氨基酸，信號肽預測表明4個蛋白分別有16、20、19和18個氨基酸的信號肽。進一步的序列分析表明MaltOBP2和MaltOBP5屬于Minus-COBP，MaltOBP3和MaltOBP4屬于ClassicOBP。同源比對表明這4個蛋白相互之間的同源性相似比較低，而在進化樹中MaltOBP2和MaltOBP5處于Minus-COBP的亞支，MaltOBP3和

6、MaltOBP4位于ClassicOBP亞支，但是4個OBPs都處于不同的分支上，以上表明4個OBPs屬于不同的亞族，可能它們在松褐天牛具有不同的功能。
　　3、松褐天牛OBPs的原核表達、蛋白純化及熒光結合特性分析
　　成功構建松褐天牛OBPs基因原核表達載體pGEX-6p-1-MaltOBPx，4個OBPs基因都能在大腸桿菌BL21(DE3)pLysS中表達，但是在常溫時均表達在包涵體中不利于蛋白純化，改變誘導條件成功使

7、pGEX-6p-1-MaltOBP3和pGEX-6p-1-MaltOBP5在上清中表達，通過GST親和層析柱純化獲得純度較高的融合蛋白，利用Precissionprotease切除標簽獲得獲得純化的目的蛋白。
　　通過競爭結合實驗以1-NPN為探針研究MaltOBP3和MaltOBP5與17種揮發(fā)物的結合能力。結果表明，MaltOBPs表現(xiàn)出不同的結合特性，MaltOBP3和MaltOBP5與(+)-檸檬烯氧化物、(-)-檸檬烯、