丹參酮對LPS誘導(dǎo)NF-κB活性增加的拮抗作用及其機(jī)理初探.pdf

1、該實(shí)驗(yàn)從臨床經(jīng)驗(yàn)方DXR中選取丹參作為研究對象,并借鑒炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究的進(jìn)展,推測丹參酮可以拮抗LPS加強(qiáng)NF-κB活性的作用,從而可以抑制炎癥細(xì)胞在動脈管壁集聚,抑制動脈粥樣硬化斑塊形成.旨在了解Tan對LPS增強(qiáng)NF-κB表達(dá)活性,并導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子大量釋放的作用,從信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的角度闡明Tan拮抗LPS致炎作用的可能機(jī)制;為DXR拮抗LPS,防治動脈粥樣硬化的臨床應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù);并為中醫(yī)藥復(fù)方研究提供新的思路,為中藥在分子水平

2、上的作用尋找新的藥物靶標(biāo).二、方法采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的細(xì)胞基因共轉(zhuǎn)染技術(shù)將含NF-κB的質(zhì)粒pNF-κB-TA-Luc和β-半乳糖苷酶表達(dá)質(zhì)粒pCMV-β共轉(zhuǎn)染人胚胎腎細(xì)胞HEK-293細(xì)胞,用細(xì)菌脂多糖(LPS)、丹參酮(Tan)刺激轉(zhuǎn)染后的HEK-293細(xì)胞,檢測并比較熒光素酶/β-半乳糖苷酶活性,以確定LPS和Tan對NF-κB活性的影響;以基因重組技術(shù)構(gòu)建含全長TLR4重組腺病毒Ad-TLR4和含細(xì)胞內(nèi)段缺失的TLR4重組腺病毒Ad

3、-△TLR4;采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的細(xì)胞基因共轉(zhuǎn)染技術(shù)將含NF-κB的質(zhì)粒pNF-κB-TA-Luc和β-半乳糖苷酶表達(dá)質(zhì)粒pCMV-β共轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞,并加用重組腺病毒感染,給以細(xì)菌脂多糖(LPS)、丹參酮(Tan)刺激,檢測并比較熒光素酶/β-半乳糖苷酶活性,以確定LPS-TLR4通路在NF-κB激活中的作用;利用改進(jìn)后的T7噬菌體展示篩選系統(tǒng)對TLR4相互作用蛋白進(jìn)行初步的篩選.四、結(jié)論1、正確構(gòu)建了含TLR4全長和細(xì)胞外段的重組

4、腺病毒,并在CHO-K<,1>細(xì)胞得到良好的表達(dá).2、利用報(bào)告基因技術(shù)顯示了LPS對細(xì)胞內(nèi)NF-κB活性的增強(qiáng)作用,并發(fā)現(xiàn)Tan對這一增強(qiáng)作用有明顯的抑制效應(yīng).3、利用重組腺病毒技術(shù)驗(yàn)證了LPS對NF-κB的活性增強(qiáng)作用主要是通過TLR4受體通路實(shí)現(xiàn)的,并發(fā)現(xiàn)了Tan對LPS的調(diào)節(jié)作用也是通過這一通路實(shí)現(xiàn)的.4、從分子水平闡明了Tan抑制LPS效應(yīng)的作用機(jī)制,為DXR防治動脈粥樣硬化的臨床應(yīng)用提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)5、為中醫(yī)藥復(fù)方研究提供