缺血再灌注損傷時(shí)氧化應(yīng)激對(duì)血視網(wǎng)膜內(nèi)屏障的損傷作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　1.建立大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注(IR)模型，并觀察氧化應(yīng)激在血視網(wǎng)膜內(nèi)屏障損傷中的作用。
　　2.建立血視網(wǎng)膜內(nèi)屏障的體外模型，應(yīng)用缺氧再氧合(HR)損傷模擬體內(nèi)IR損傷，并觀察氧化應(yīng)激在血視網(wǎng)膜內(nèi)屏障體外模型損傷中的作用。
　　3.探討PI3K/Akt/GSK3β/β-catenin通路是否參與HR時(shí)氧化應(yīng)激對(duì)血視網(wǎng)膜內(nèi)屏障的損傷。
　　方法:
　　1.應(yīng)用升高大鼠前房眼內(nèi)壓的方法建立大鼠視網(wǎng)膜

2、IR模型，將大鼠分為control組、IR組和IR+diosmin組，運(yùn)用視網(wǎng)膜電流圖檢測(cè)各組視網(wǎng)膜功能學(xué)改變，HE染色觀察視網(wǎng)膜水腫的情況，應(yīng)用伊文斯蘭大鼠體內(nèi)灌注和透射電子顯微鏡分別觀察大鼠視網(wǎng)膜毛細(xì)血管的滲透性和內(nèi)皮細(xì)胞之間緊密連接結(jié)構(gòu)的完整性，并檢測(cè)MDA的含量以及SOD、GSH-Px、CAT的活性以判斷大鼠視網(wǎng)膜組織中氧化抗氧化體系的情況，其余的大鼠處死后采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR、WestemBlot以及免疫組織化學(xué)等方法觀察

3、VEGF、PEDF在視網(wǎng)膜組織中的表達(dá)和分布。
　　2.原代培養(yǎng)牛視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞（BRECs），取原代培養(yǎng)后傳代至第5-9代的BRECs以1.5×105個(gè)/CII12細(xì)胞密度接種于Transwell膜上，建立穩(wěn)定的血視網(wǎng)膜內(nèi)屏障體外模型，并通過(guò)跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻、滲透性實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)屏障功能和結(jié)構(gòu)的完整性。對(duì)已經(jīng)建立血視網(wǎng)膜內(nèi)屏障的內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)用HR進(jìn)行干預(yù)。細(xì)胞分為空白組、control組、HR組和HR+NAC組，運(yùn)用

4、跨細(xì)胞電阻儀和示蹤劑RD檢測(cè)各組內(nèi)皮細(xì)胞之間的跨細(xì)胞電阻和滲透性，運(yùn)用ROS探針CM-H2DCFDA檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)ROS的含量，運(yùn)用ELISA法檢測(cè)各組內(nèi)皮細(xì)胞分泌的VEGF和PEDF的含量。
　　3.取原代培養(yǎng)后傳代至第5-9代的BRECs建立血視網(wǎng)膜內(nèi)屏障的體外模型，將細(xì)胞分為空白組、control組、HR組、HR+NAC組和HR+LY294002（PI3K/Akt通路抑制劑）組，應(yīng)用跨細(xì)胞電阻儀和示蹤劑RD檢測(cè)各組內(nèi)皮細(xì)胞之

5、間的跨細(xì)胞電阻和滲透性，應(yīng)用WestemBlot法檢測(cè)pAkt及其下游GSK3β，β-catenin的蛋白表達(dá)，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)β-catenin下游基因MMP9在mRNA水平的表達(dá)，并運(yùn)用細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)BRECs細(xì)胞膜上緊密連接蛋白ZO-1和occludin的表達(dá)和分布。
　　結(jié)果:
　　1.IR損傷24小時(shí)后，IR組視網(wǎng)膜組織中的MDA含量較正常對(duì)照組顯著增加，抗氧化物質(zhì)SOD、GSH-Px和CAT活性顯

6、著下降(P＜0.05)，伴隨著視網(wǎng)膜明顯的水腫，視網(wǎng)膜內(nèi)層、外層及總的厚度均出現(xiàn)顯著增加（P＜0.05），視網(wǎng)膜電流圖結(jié)果顯示IR損傷造成了a波和b波的顯著下降（P＜0.05），視網(wǎng)膜毛細(xì)血管滲透性顯著增加(P＜0.05)，內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接開(kāi)放，VEGF和PEDF的比值在mRNA和蛋白水平上均顯著增加，緊密連接蛋白ZO-1和occludin表達(dá)下降(P＜0.05)。地奧司明的干預(yù)顯著的逆轉(zhuǎn)了上述過(guò)程。
　　2.原代培養(yǎng)的BR

7、ECs在Transwell膜上培養(yǎng)13天后，其TER值達(dá)到最高點(diǎn)為48.9±2.1Ω·cm2，并且此時(shí)單層BRECs細(xì)胞對(duì)于RD的通透性最低，通過(guò)細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)此時(shí)BRECs細(xì)胞膜上ZO-1和occludin表達(dá)均勻連續(xù)，顯示出清晰的細(xì)胞輪廓，因此認(rèn)為此時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接形成，血視網(wǎng)膜內(nèi)屏障的體外模型建立。HR造成BRECs細(xì)胞中ROS顯著增加，伴隨著B(niǎo)RECs分泌的VEGF和PEDF比值的增加以及TER的降低和通透性的增加（P

8、＜0.05），抗氧化劑NAC的預(yù)處理通過(guò)抑制ROS顯著地逆轉(zhuǎn)了HR造成的上述變化。說(shuō)明氧化應(yīng)激參與了HR對(duì)血視網(wǎng)膜內(nèi)屏障的損害。
　　3.NAC顯著抑制了HR造成的Akt的磷酸化(P＜0.05)，LY294002和NAC均顯著逆轉(zhuǎn)了HR造成的GSK3β活性的降低(P＜0.05)以及細(xì)胞中β-catenin含量的增加，抑制了下游MMP9在基因水平上表達(dá)的增加，減輕了BRECs細(xì)胞膜上緊密連接蛋白ZO-1和occludin的表達(dá)和分布

9、的變化，LY294002干預(yù)的單層BRECs的TER較HR組顯著增加（P＜0.05），通透性顯著降低（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.IR損傷中，氧化應(yīng)激參與了血視網(wǎng)膜內(nèi)屏障的破壞，地奧司明可以通過(guò)發(fā)揮其抗氧化作用對(duì)IR時(shí)的血視網(wǎng)膜內(nèi)屏障起到一定的保護(hù)作用，減輕視網(wǎng)膜水腫。
　　2.在Transwell膜上培養(yǎng)BRECs13天后可以建立血視網(wǎng)膜內(nèi)屏障的體外模型，HR損傷時(shí)，氧化應(yīng)激反應(yīng)參與了體外建立的血視網(wǎng)膜內(nèi)屏