茯苓磷酸甲羥戊酸激酶基因克隆及功能分析.pdf

1、茯苓是一種藥食兩用、大宗的常用中藥材，是高等真菌茯苓Poria cocos(Schw.)Wolf的干燥菌核，有茯苓與茯苓皮兩味藥材。三萜類化合物是其主要活性成分之一，具有抗腫瘤、抗氧化、抗驚厥等多種生物活性。茯苓通過甲羥戊酸途徑(MVA pathway)合成萜類骨架，并進(jìn)一步形成各種活性萜類物質(zhì)。5-磷酸甲羥戊酸激酶(phosphomevalonate kinase)是MVA途徑的第5個酶，其能催化5-磷酸甲羥戊酸(MVAP)形成5-焦

2、磷酸甲羥戊酸的反應(yīng)及其逆反應(yīng)，是MVA到IPP途徑中的限速步驟;其基因表達(dá)量較低，且受下游產(chǎn)物的調(diào)節(jié)，是整個萜類合成途徑中的重要調(diào)節(jié)位點之一。本研究克隆出茯苓磷酸甲羥戊酸激酶基因(PcPMK)，通過酵母功能互補(bǔ)和體外酶促反應(yīng)驗證基因功能，并進(jìn)行了相關(guān)酶動力學(xué)研究。主要研究結(jié)果如下:
　　1成功克隆PcPMK基因利用系列方法獲得具有完整ORF的茯苓磷酸甲羥戊酸激酶基因(PcPMK) mRNA序列1662bp，基因組DNA序列3249

3、bp;基因具有6個內(nèi)含子、7個外顯子，啟動子區(qū)具有ABA、生長素、MYB等多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控位點?；蚓幋a具有511個氨基酸，預(yù)測分子量54.8kDa的不穩(wěn)定疏水性蛋白PcPMK。PcPMK蛋白序列與真菌同源性較高，系統(tǒng)發(fā)育分析表明，蛋白的聚類結(jié)果與物種分類地位一致。蛋白具有與活性相關(guān)的P-loop等3個保守功能域，且這些功能域在模擬的PcPMK3D結(jié)構(gòu)上相鄰，具有典型GHMP家族蛋白的特征。
　　2 PcPMK基因能互補(bǔ)酵母ERG8基

4、因功能構(gòu)建酵母表達(dá)載體pYES2-pcpmk，轉(zhuǎn)化至ERG8雜合突變型釀酒酵母菌株中。優(yōu)化產(chǎn)孢條件后，菌株在McClary培養(yǎng)基上25℃產(chǎn)孢培養(yǎng)15天，取細(xì)胞經(jīng)30mg/mL蝸牛酶30℃酶解約60min后，進(jìn)行四分體單孢分離，并利用營養(yǎng)表型和交配型PCR驗證得到目的單倍體酵母菌株。目的菌株定量接種到5種不同的培養(yǎng)基上，進(jìn)行基因功能互補(bǔ)展示，得到預(yù)期互補(bǔ)結(jié)果，證明克隆得到的PcPMK基因具有PMK基因活性。
　　3重組PcPMK蛋白

5、具有5-磷酸甲羥戊酸激酶功能構(gòu)建原核表達(dá)載體pCold-pcpmk，并轉(zhuǎn)化至E.coli表達(dá)菌株BL21(DE3)，優(yōu)化了蛋白表達(dá)條件，并利用優(yōu)化后的蛋白純化方法得到純化后PcPMK蛋白。利用原核表達(dá)純化的PcPMK蛋白、底物MVAP和ATP進(jìn)行體外酶促反應(yīng)，UPLC-MS分析反應(yīng)產(chǎn)物中有目的產(chǎn)物5-焦磷酸甲羥戊酸和ADP的生成，證明表達(dá)的重組PcPMK蛋白具有ATP:5-磷酸甲羥戊酸磷酸轉(zhuǎn)移酶催化功能。
　　4 PcPMK是一種

6、Mn2+依賴型酶進(jìn)一步對PcPMK蛋白進(jìn)行酶動力學(xué)研究表明，PcPMK是一種Mn2+依賴型酶，Mg2+也能部分激活其活性。PcPMK酶對ATP的濃度敏感，高濃度ATP能抑制酶活性。利用丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶偶聯(lián)的微孔板連續(xù)監(jiān)測法測定PcPMK酶活性:對于底物ATP，酶的米氏常數(shù)Km為67.7±7.5μmol/L，最大反應(yīng)速率Vmax為6.21±0.19μmol/min/mg蛋白;對MVAP的Km為104.3±9.8μmol/L,Vmax