脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSC)調(diào)控變應(yīng)性鼻炎模型鼠T細(xì)胞免疫狀態(tài)的研究.pdf

1、背景:
　　 變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是一種呈全球蔓延的鼻腔過敏性疾病，最新根據(jù)變應(yīng)性鼻炎評分(Score for Allergic Rhinitic，SFAR)標(biāo)準(zhǔn)其發(fā)病率為31.6％，嚴(yán)重困擾著人們生活、學(xué)習(xí)和工作。變應(yīng)性鼻炎發(fā)病涉及環(huán)境及遺傳兩個方面，近年提出了Th1/Th2免疫反應(yīng)平衡障礙學(xué)説，即AR的發(fā)病主要是Th2型細(xì)胞免疫反應(yīng)優(yōu)勢，通過介導(dǎo)多種炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子的釋放，而導(dǎo)致一系列鼻過

2、敏癥狀。因此，糾正以Th2型免疫反應(yīng)過度為主而恢復(fù)Th1/Th2細(xì)胞免疫平衡的治療方式成為重要的策略。
　　 T淋巴細(xì)胞來源于骨髓的淋巴樣干細(xì)胞，按免疫效應(yīng)功能可分為輔助性T細(xì)胞(Th)、細(xì)胞毒性T細(xì)胞(Tc/CTL)、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)、抑制性T細(xì)胞(Ts)等。Th1/Th2免疫反應(yīng)失衡的調(diào)節(jié)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)是目前世界范圍內(nèi)的兩大研究熱點(diǎn)。輔助性T細(xì)胞(Th)主要分為:Th1、Th2和Th17。Th1細(xì)胞主要分

3、泌IL-2、IFN-γ、TNF，參與細(xì)胞免疫及遲發(fā)型超敏反應(yīng)的發(fā)生?？乖禺愋訲h2細(xì)胞在變應(yīng)性免疫反應(yīng)中通過釋放大量的Th2型細(xì)胞因子（IL-4、5、6、10、13等）啟動和維持炎癥，其中IL-4和IL-13，它調(diào)節(jié)抗原特異性IgE的同型轉(zhuǎn)換，IL-5可募集和激活嗜酸性粒細(xì)胞。Th1和Th2型細(xì)胞因子相互拮抗，選擇性抑制Th2反應(yīng)可能對防止變應(yīng)性炎癥至關(guān)重要。Treg細(xì)胞具有調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡、抑制T淋巴細(xì)胞增殖和促進(jìn)DC細(xì)胞成熟

4、等作用。Treg細(xì)胞的免疫缺陷是近年來變應(yīng)性疾病研究的重大發(fā)現(xiàn)之一，其中包括AR，已有研究表明變應(yīng)性個體中存在變應(yīng)原特異性Treg細(xì)胞數(shù)量和（或）功能的缺陷，并認(rèn)為可能是AR免疫失衡的重要原因。
　　 間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)屬于中胚層的一類成纖維樣多能干細(xì)胞，在人體骨髓、脂肪、臍帶血等組織中都有其分布，具有自我更新、多向分化和再生修復(fù)實(shí)質(zhì)組織器官的潛能。此外，因其還具有獨(dú)特的低免疫

5、原性和免疫調(diào)節(jié)作用使其成為干細(xì)胞研究領(lǐng)域的一顆新星。MSC可通過誘導(dǎo)細(xì)胞分裂阻滯來抑制T、B和DC細(xì)胞的增殖，還可抑制NK細(xì)胞的增殖和削弱DC細(xì)胞的成熟狀態(tài)，以及抗原呈遞。MSC依據(jù)靶器官中炎癥微環(huán)境而實(shí)施有益的免疫調(diào)節(jié)，而無論是Th1免疫反應(yīng)偏移還是Th2型免疫反應(yīng)偏移。在變應(yīng)性鼻炎及哮喘等Th2型免疫反應(yīng)優(yōu)勢的變態(tài)反應(yīng)疾病中，MSC可顯著下調(diào)Th2型免疫反應(yīng)而恢復(fù)Th1/Th2細(xì)胞免疫平衡，并可上調(diào)CD4+CD25+Treg細(xì)胞的比

6、例。脂肪組織來源的MSC，即ADSC，與其他來源MSC一樣具有獨(dú)特的非特異性免疫調(diào)節(jié)作用。脂肪組織相比骨髓更豐富，且更易收獲更多量成體干細(xì)胞。
　　 目前，AR治療包括藥物對癥處理及特異性免疫治療，藥物對癥處理僅對發(fā)作期患者起控制病情作用，維持時間短，停藥復(fù)發(fā)，特異性免疫治療因治療患者群受變應(yīng)原限制，治療周期長，部分患者依從性差，或半途脫落而導(dǎo)致相當(dāng)一部分患者放棄脫敏治療。因而探尋新的治療方式勢在必行。初步的研究表明，ADSC對

7、Th1/Th2免疫反應(yīng)失衡及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞具有復(fù)雜的調(diào)節(jié)作用。選擇ADSC重新調(diào)整AR患者Th1/Th2細(xì)胞免疫平衡及Treg細(xì)胞治療模式成為一項(xiàng)具有創(chuàng)新性的設(shè)計(jì)策略。因此，本研究在構(gòu)建變應(yīng)性鼻炎模型鼠的基礎(chǔ)上探討體外膠原酶消化合并貼壁篩選法分離培養(yǎng)的小鼠ADSC對模型鼠輔助性T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制。本研究的開展有可能將為今后AR臨床治療開辟一個嶄新的領(lǐng)域奠定基礎(chǔ)。
　　 研究目的:
　　 探討體外分離培養(yǎng)

8、小鼠ADSC，并在構(gòu)建變應(yīng)性鼻炎模型鼠的基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討ADSC對模型鼠輔助性T細(xì)胞、Treg細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制。
　　 材料及方法:
　　 1實(shí)驗(yàn)材料及動物
　　 胰蛋白酶、DMEM/F12、胎牛血清、青-鏈霉素雙抗、二甲亞砜(DMSO)、膠原酶Ⅰ型、間充質(zhì)干細(xì)胞成脂/成骨/成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基、Balb/c小鼠、卵清蛋白Ⅴ級、Ⅱ級、CM-Dil、Trizol、RT-PCR試劑、逆轉(zhuǎn)錄酶、DEPC、Mous

9、eIL-4 ELISA Kit、Mouse IL-6 ELISA Kit、Mouse IL-10 ELISA Kit、MouseIFN-γ ELISA Kit。
　　 Balb/c小鼠[6-8周，雄性，體質(zhì)量18-25g，由南方醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供（合格證scxk粵2011-0015）。]
　　 2方法
　　 2.1 ADSC的分離、培養(yǎng)
　　 取10只清潔級Balb/c小鼠，斷頸處死，完全浸泡于75

10、％酒精中約5分鐘消毒，無菌取腹股溝處及附睪周圍脂肪組織，剔除肉眼可見的小血管及結(jié)締組織，含高濃度青霉素(300U/ml)+鏈霉素(300ng/ml)的PBS沖洗3次。眼科剪盡可能剪碎，加入2倍體積的0.1％的Ⅰ型膠原酶，37℃水浴鍋中震蕩消化約30 min，加入2倍體積的PBS液混勻，100目的篩網(wǎng)過濾，1200×g離心10min，移液器輕輕吸棄油性上清，沉淀用PBS洗滌3次，含10％胎牛血清的DMFM/F12培養(yǎng)基重懸，接種于25ml

11、培養(yǎng)瓶中于37℃5％CO2孵箱中培養(yǎng)。24小時后首次換液，以去除殘余的紅細(xì)胞及未貼壁的細(xì)胞。以后每2-3天換液一次，細(xì)胞長滿80％用胰酶消化傳代培養(yǎng)。
　　 2.2流式檢測ADSC的表面標(biāo)記
　　 收集第3～5代ADSC約2×106個，1200×g離心4min棄上清。Buffer溶液重懸，吸取100μl細(xì)胞懸液（約3.0×105個細(xì)胞）加入Ep管內(nèi)。加入適量抗體，避光孵育30min。每樣品管加入1.5～2mi Buffe

12、r溶液，1200×g離心4min棄上清。每樣品管加入300μl Buffer溶液重懸后流式細(xì)胞儀檢測。
　　 2.3 ADSC成脂、成骨及成軟骨誘導(dǎo)分化
　　 取生長狀態(tài)良好的第3～5代ADSC，待細(xì)胞達(dá)到100％融合時，吸棄舊培養(yǎng)液。先加入2ml/孔的成脂誘導(dǎo)完全培養(yǎng)基A開始誘導(dǎo)，三天后更換為成脂誘導(dǎo)完全培養(yǎng)基B，24h后，再次更換為成脂誘導(dǎo)完全培養(yǎng)基A，如此進(jìn)行2個循環(huán)。繼續(xù)培養(yǎng)待胞內(nèi)脂滴已較成熟時，對其進(jìn)行油紅0染

13、色。
　　 取生長狀態(tài)良好的第3～5代ADSC，待細(xì)胞達(dá)到70～80％融合時后，吸棄舊培養(yǎng)液，加入2ml/孔的成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基。每三天換液，直至可觀察到明顯鈣結(jié)節(jié)。鏡下觀察見細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)變多，分化情況較恒定時，進(jìn)行茜素紅染色。
　　 取生長狀態(tài)良好的第3～5代ADSC，消化離心棄上清，按7.5×105/ml加入軟骨誘導(dǎo)基礎(chǔ)液重懸細(xì)胞，1100×g離心5min棄上清，按5.0×105/ml加入軟骨誘導(dǎo)完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞

14、;吸取500μl細(xì)胞懸液（即2.5×105個細(xì)胞）至15ml離心管中，1100×g離心5min;離心后不可搖動或吹打細(xì)胞團(tuán)，擰松離心管蓋，置于37℃，5％CO2中孵育（24 h內(nèi)避免搖動細(xì)胞團(tuán)）。每2～3天半量更換軟骨分化誘導(dǎo)液，并輕彈使其脫離管壁懸浮。繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)待細(xì)胞團(tuán)增大后，送做石蠟切片，進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色。
　　 2.4變應(yīng)性鼻炎小鼠模型的建立、采用尾靜脈注射ADSC處理模型鼠
　　 2.4.1致敏液和激發(fā)液的配制

15、
　　 OVA致敏液:稱取卵清蛋白Ⅴ(OVAⅤ)2mg，溶于4ml無菌PBS液中，常溫下震蕩溶解配成500ug/ml的OVA溶液;稱取適量明礬（氫氧化鋁），溶于適量無菌PBS液中，超聲波下完全溶解配成10％的明礬溶液，取4ml明礬溶液加入OVA溶液中并充分混勻，用10N NaOH溶液調(diào)整PH至6.5，室溫靜置孵育60min，1200×g離心5min，吸棄上清，沉淀用無菌PBS液重懸至4ml，渦旋振蕩器充分震蕩搖勻。
　　

16、 OVA激發(fā)液:稱取卵清蛋白Ⅱ(OVAⅡ)40mg，溶于1ml無菌PBS液中，使用前充分混勻。
　　 2.4.2致敏和激發(fā)
　　 Balb/c小鼠，60只，適應(yīng)性飼養(yǎng)3d后完全隨機(jī)分為6組（分組表示為:致敏/激發(fā)/處理），隨機(jī)選組分別為實(shí)驗(yàn)組1（OVA/OVA/高劑量ADSC）、實(shí)驗(yàn)組2（OVA/OVA/低劑量ADSC）、實(shí)驗(yàn)組3(OVA/OVA/PBS)、實(shí)驗(yàn)組4(OVA/OVA/O)、對照組1(PBS/PBS/O)和

17、對照組2(O/O/O)。實(shí)驗(yàn)組1-4和對照組1分別于第0、7、14天的相同時間，1ml無菌注射器取現(xiàn)配的OVA致敏液和PBS液200ul/只（實(shí)驗(yàn)組1-4即100ug）進(jìn)行基礎(chǔ)致敏。第15-19 d，每天相同時間以現(xiàn)配的OVA激發(fā)液（和PBS液）20ul（每側(cè)鼻孔10ul，共800ug）進(jìn)行滴鼻激發(fā)。滴鼻結(jié)束后立即觀察雙鼻流涕、撓鼻及噴嚏情況并記錄（將其一次性連續(xù)多次抓鼻視為一次反應(yīng)）。對照組2不做任何處理。
　　 2.4.3

18、CM-Dil熒光探針標(biāo)記ADSC
　　 取第3～5代長滿約80％的ADSC，DPBS洗滌細(xì)胞，胰酶消化，重懸于DPBS液中并計(jì)數(shù)，每106個細(xì)胞加入500ul的2uM的CM-Dil，37℃孵育5min，4℃孵育15min，PBS洗滌3次，重懸于PBS中調(diào)整細(xì)胞密度分別為:高濃度ADSC液:3×107/ml和低濃度ADSC液:1×107/ml。
　　 2.4.4尾靜脈注射ADSC處理模型鼠
　　 對致敏組1、2和3

19、分別于致敏激發(fā)第20～22天，溫鹽水擦拭暴露鼠尾靜脈后，1ml注射器分別抽取0.1ml的高濃度ADSC液(即高劑量ADSC)、低濃度ADSC液(即低劑量ADSC)和PBS液對相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)鼠進(jìn)行尾靜脈注射。
　　 2.4.5癥狀學(xué)分析:
　　 從造模第1天開始觀察動物行為、形態(tài)、體征、攝食、飲水等，并于每次鼻腔激發(fā)后觀察記錄15min內(nèi)鼻清涕、噴嚏及撓鼻次數(shù)，采用疊加量化計(jì)算總分，總分大于5分視為造模成功。
　　 2

20、.5 ELISA法檢測血清中的IL-4、IL-6、IL-10及IFN-γ水平
　　 末次處理48小時后，1ml水合氯醛腹腔麻醉小鼠后摘眼球后立即收集外周血，室溫靜置2h后，1500×g離心10 min。移液槍小心吸取上層血清采用小鼠ELISA試劑盒檢測其中IL-4、IL-6、IL-10及IFN-γ水平，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。
　　 2.6熒光定量PCR法檢測脾臟組織中IL-4、IL-6、IL-10及IFN-γ的mRNA水平<

21、br>　　 末次處理48小時后，1ml水合氯醛腹腔麻醉小鼠后摘眼球取外周血并處死，固定四肢后取脾臟，TRIZOL提取總RNA，取2ugRNA模板做逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，熒光定量PCR檢測IL-4、IL-6、IL-10及IFN-γ基因表達(dá)情況。依據(jù)方法計(jì)算各組CT值，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。
　　 2.7組織學(xué)分析
　　 末次處理48小時后處死小鼠，顯微鏡下取鼻腔呼吸區(qū)粘膜，10％的甲醛溶液固定，石蠟包埋，連續(xù)切片(約3um)，進(jìn)行常規(guī)

22、HE染色，光鏡下觀察各組鼻粘膜中炎細(xì)胞的浸潤情況。熒光顯微鏡綠色激發(fā)光下觀察CM-Dil標(biāo)記的ADSC在小鼠鼻粘膜（鼻粘膜白片）的遷移。
　　 2.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，結(jié)果以(X)±S表示。多個樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析;Levene方差齊性檢驗(yàn)，若方差不齊，用基于方差不齊的近似F檢驗(yàn)Welch法;多重比較采用LSD（方差齊時）或Dunnett's T3法（方差不齊時）。P＜0

23、.05為差異有顯著性意義。
　　 結(jié)果:
　　 1、小鼠ADSC的分離、培養(yǎng)
　　 接種24小時后，顯微鏡下可見少數(shù)細(xì)胞貼壁生長，形態(tài)不均一，呈短梭形、多角形，折光性較差。48小時后貼壁細(xì)胞明顯增多，逐漸開始伸展，呈長梭形，有粗大突起，立體感增強(qiáng)。混雜生長細(xì)胞隨換液及傳代次數(shù)增加而明顯減少。
　　 2、ADSC的表面標(biāo)記鑒定
　　 流式細(xì)胞表面標(biāo)志鑒定可見ADSC陽性表達(dá)CD44(31.60％)，

24、陰性表達(dá)CD106(4.98％)、CD34(10.46％)和CD45(12.43％)。
　　 3、ADSC成脂、成骨及成軟骨分化
　　 成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)3d后，顯微鏡下細(xì)胞立體感漸增強(qiáng)，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)小脂滴部分開始融合，約6d左右胞內(nèi)脂滴數(shù)量漸增加，細(xì)胞由長梭形漸變?yōu)轭悎A形、多邊形，油紅0染色可見胞內(nèi)大量脂質(zhì)沉淀;
　　 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)誘導(dǎo)后細(xì)胞漸呈多角形，約10 d后，胞質(zhì)內(nèi)可見大量顆粒，細(xì)胞呈集落樣生長，細(xì)胞間可見

25、鈣質(zhì)沉積;繼續(xù)培養(yǎng)集落中心的細(xì)胞漸融合失去細(xì)胞結(jié)構(gòu)，形成鈣結(jié)節(jié)，經(jīng)茜素紅染色見紅色結(jié)節(jié);
　　 成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后細(xì)胞團(tuán)直徑緩慢增大，表面漸光滑呈膠質(zhì)，誘導(dǎo)20天左右后甲苯胺藍(lán)染色呈淡藍(lán)色。
　　 4、癥狀學(xué)評分:
　　 實(shí)驗(yàn)組1-4的40只鼠在鼻腔激發(fā)后的15min內(nèi)，前5min小鼠即出現(xiàn)反復(fù)雙前爪撓鼻、連續(xù)性噴嚏及多量清涕，后10min噴嚏間隙延長，撓鼻及清涕無明顯變化，評分都大于5分，視為造模成功，其中8只出

26、現(xiàn)陣發(fā)性撓耳、撓頸等癥狀。對照組1的10只鼠在致敏激發(fā)后的15min內(nèi)，前5min小鼠均出現(xiàn)反復(fù)雙前爪撓鼻，但連續(xù)性噴嚏及清涕不明顯，評分小于或等于5。
　　 實(shí)驗(yàn)組1-4和對照組1、2比較，F(xiàn)=414.912，P=0.000，方差齊(P=0.280)進(jìn)一步采用LSD法進(jìn)行多重比較，實(shí)驗(yàn)組1-4的癥狀學(xué)評分較對照組1、2均具有顯著差異（分別為P=0.000，P=0.000），對照組1與2間無顯著性差異(P=0.483)。提示實(shí)驗(yàn)

27、組1-4的癥狀學(xué)評分具有顯著性差異。
　　 5、ELISA法檢測血清中的IL-4、IL-6、IL-10及IFN-γ的水平
　　 按照ELISA試劑盒說明書操作，實(shí)驗(yàn)組1血清中IL-4和IL-6水平顯著下降（與實(shí)驗(yàn)組4比較，P＜0.05），IL-10和IFN-γ水平顯著增加（與實(shí)驗(yàn)組4比較，P＜0.05）;實(shí)驗(yàn)組2血清中IL-6水平顯著下降(與實(shí)驗(yàn)組4比較，P＜0.05)，IL-10水平顯著增加（與實(shí)驗(yàn)組4比較，P＜0.0

28、5），IL-4和IFN-γ的水平無顯著性變化（與實(shí)驗(yàn)組4比較，P＞0.05），盡管二者分別具有降低和增加的趨勢。這提示全身應(yīng)用ADSC可影響AR模型鼠Th1、Th2及Treg細(xì)胞的分泌，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體Th1/Th2免疫狀態(tài)和Treg細(xì)胞，并在一定程度上存在ADSC劑量依賴性。
　　 實(shí)驗(yàn)組4血清中IL-4和IL-6水平顯著升高（與對照組2比較，P＜0.05），IL-10和IFN-γ水平顯著降低（與實(shí)驗(yàn)組4比較，P＜0.05）。這提

29、示本研究采用OVA+Alum方案成功構(gòu)建了變應(yīng)性鼻炎模型鼠，模型鼠存在Th1/Th2免疫失衡和Treg細(xì)胞功能缺陷。
　　 6、熒光定量PCR法檢測脾臟組織的IL-4、IL-6、IL-10及IFN-γ mRNA的表達(dá)
　　 實(shí)驗(yàn)組1脾臟中IL-4和IL-6的mRNA水平顯著下降(與實(shí)驗(yàn)組4比較，P＜0.05)，IL-10和IFN-γ的mRNA水平顯著升高（與實(shí)驗(yàn)組4比較，P＜0.05）;實(shí)驗(yàn)組2中IL-6的mRNA水平顯

30、著下降（與實(shí)驗(yàn)組4比較，P＜0.05），IL-10的mRNA水平顯著升高（與實(shí)驗(yàn)組4比較，P＜0.05），IL-4和IFN-γ的mRNA水平無顯著性變化（與實(shí)驗(yàn)組4比較，P＞0.05）.這提示全身應(yīng)用ADSC可從基因水平影響AR模型鼠Th1、Th2及Treg細(xì)胞的分泌，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體Th1/Th2免疫狀態(tài)和Treg細(xì)胞，并在一定程度上存在ADSC劑量依賴性。
　　 實(shí)驗(yàn)組4中IL-4和IL-6的mRNA水平顯著升高（與對照組2比較

31、，P＜0.05），IL-10和IFN-γ的mRNA水平顯著降低（與實(shí)驗(yàn)組4比較，P＜0.05）。這提示本研究采用OVA+Alum方案成功構(gòu)建了變應(yīng)性鼻炎模型鼠，模型鼠在基因水平存在Th1/Th2免疫失衡和Treg細(xì)胞功能缺陷。
　　 7、CM-Dil標(biāo)記的ADSC在鼻粘膜的遷移
　　 鼻粘膜切片在熒光顯微鏡綠色激發(fā)光下可見CM-Dil標(biāo)記的ADSC呈紅色熒光，可遷移至小鼠鼻粘膜，主要分布于鼻粘膜上皮層和上皮下層，實(shí)驗(yàn)組1

32、（OVA/OVA/高劑量ADSC）明顯多于實(shí)驗(yàn)組2（OVA/OVA/低劑量ADSC）。
　　 8、鼻粘膜組織學(xué)分析
　　 實(shí)驗(yàn)組4:嗜酸性粒細(xì)胞主要分布于粘膜固有層，并且基底膜增厚，間質(zhì)水腫;實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2粘膜中無明顯嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，基底膜增厚和間質(zhì)水腫明顯低于實(shí)驗(yàn)組4。
　　 結(jié)論:
　　 1、Balb/c小鼠雙側(cè)腹股溝及附睪周圍是脂肪組織良好的取材部位。采用膠原酶消化合并貼壁篩選法可分離獲得AD