人多肽：N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶2結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的初步研究.pdf

1、目的：多肽：N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶家族是催化0-糖鏈起始反應(yīng)的第一步酶，其活性與腫瘤密切有關(guān)。本文旨在建立酵母雙雜交技術(shù)平臺，并對多肽：N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶2結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系進(jìn)行初步研究。方法：1．利用PDB數(shù)據(jù)庫尋找ppGalNAcT2模版，并用SWISS-MODEL服務(wù)器對ppGalNAcT2進(jìn)行空間結(jié)構(gòu)模擬，對結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化及PROCHECK檢測。2．利用PCR方法重組構(gòu)建pGADT7一T2、pC-ADTT-T2F、pGADT7

2、一T2R酵母雙雜交載體，醋酸鋰法轉(zhuǎn)化酵母AHl09菌株，并進(jìn)行激活檢測。3．利用RT—PCR方法從人類胃癌SGC7901細(xì)胞中克隆出基質(zhì)金屬蛋白酶14的鉸鏈區(qū)，并用酵母雙雜交方法驗證ppGalNAcT2與MMPl4的鉸鏈區(qū)結(jié)構(gòu)相互作用。結(jié)果：成功對ppGalNAcT2進(jìn)行同源模擬。構(gòu)建了pGADT7一T2、pGADT7-T2F、pGADT7一T2R酵母雙雜交載體，并通過激活檢測，建立酵母雙雜交技術(shù)平臺。從SGC7901細(xì)胞中克隆出MMP

3、l4鉸鏈區(qū)結(jié)構(gòu)，構(gòu)建了MMPl4H-pGBKT7載體，對ppGalNAcT2和IVlMPl4鉸鏈區(qū)進(jìn)行酵母雙雜交驗證，結(jié)果成陰性。結(jié)論：ppGalNAcT2催化區(qū)包括三個結(jié)構(gòu)域。ppGalNAcT2通過激活檢測，能夠用于酵母雙雜交實驗。ppGalNAcT2與MMPl4鉸鏈區(qū)酵母雙雜交實驗的陰性結(jié)果表明，ppGalNAcT2作為蛋白質(zhì)與~VIPl4鉸鏈區(qū)可能無穩(wěn)定的相互結(jié)合作用：但是作為一個酶，是否催化MMPl4鉸鏈區(qū)的0一糖基化，有待于