金安粉誘導肺癌細胞凋亡作用及對survivin通路的影響.pdf

1、肺癌為當今世界大多數(shù)國家發(fā)病率居第一位的惡性腫瘤，從20世紀中葉開始其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升，目前治療效果差，化療藥物療效不理想，且毒副作用大，延長肺癌患者的生存期，提高患者的生存質量，已成為防治肺癌的最主要目標和難題。近年來對于中藥單體的研究表明：多數(shù)中藥單體單獨抑瘤作用并不如化療藥顯著，但國內外多項研究已表明，中藥復方多種成分混合作用于人體對于穩(wěn)定瘤灶，消除亞臨床病灶，提高術后中位生存期有顯著的作用。選用有確切活性成分和療效顯著的

2、中藥復方進行研究，能夠展現(xiàn)中醫(yī)藥防治重大疾病的巨大作用，從而為醫(yī)學界所關注。Survivin是迄今發(fā)現(xiàn)的最強凋亡抑制因子，也是當前腫瘤凋亡研究領域中的熱點，國內個別學者已開始了中藥對該靶點的影響，但系統(tǒng)研究還未開展；金安粉是一種由四種單體組成的混合物，主要含苦參堿、氧化苦參堿、黃芪多糖、川芎嗪等成分，其配比是在臨床對于肺癌術后患者防復發(fā)轉移行之有效的中藥配方的基礎上，經(jīng)過前期動物體內正交實驗得到抑瘤最佳組分配伍比例。前期藥效學動物實驗發(fā)

3、現(xiàn)該藥的抑瘤作用明顯，可提高小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能，對ConA誘導的脾淋巴細胞增殖有明顯影響，并有較好的抗Lewis肺癌移植瘤肺轉移的作用。前期毒性試驗實驗證明其具有穩(wěn)定、安全，無明顯骨髓抑制作用，前期的單體組分體外藥效學實驗表明：金安粉的活性成分均具有直接或間接的抑瘤效果。前期探討金安粉對C57BL/6J小鼠Lewis肺癌的抑制效應及其作用機制的結果表明：金安粉各劑量組的抑瘤率依次為45-79﹪、40-90﹪、32-48﹪，流式細胞

4、儀檢測金安粉誘導腫瘤細胞的凋亡率分別為24-19﹪、14-95﹪和13-93﹪，并經(jīng)統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)金安誘導腫瘤細胞的凋亡率與劑量之間存在依賴關系。前期動物實驗表明，金安粉具有抑制小鼠Lewis肺癌移植瘤體內生長作用；促進腫瘤細胞凋亡可能是金安粉治療Lewis肺癌的主要作用方式。前期體內體外的藥物篩選實驗證明，在體外培養(yǎng)PG.PAa肺癌細胞，金安粉可顯著抑制兩種細胞的生長，在熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡以及透射電鏡下均可見典型的凋亡形態(tài)改

5、變，結果表明：金安粉抑制腫瘤細胞生長可能是通過改變細胞周期，誘導腫瘤細胞凋亡等途徑來實現(xiàn)的。本試驗旨在開展金安粉誘導肺癌細胞凋亡的研究及對于Survivin基因的所在的凋亡通路的影響，來探討中藥復方誘導凋亡的具體機制，分三部分進行。 第一部分金安粉對肺癌細胞株的抑制作用 目的：研究金安粉對肺癌細胞株A549和H446的抑制作用，篩選出對肺癌細胞株A549和H446敏感的藥物濃度，同時觀察中藥同化療藥物合用的作用效果。

6、 方法：本研究通過MTS試驗，研究不同濃度金安粉、各組成藥物單體、VP-16、PDD，及金安粉配合PDD、金安粉配合VP-16在不同的時間對肺癌細胞株A549和H446的抑制作用，計算藥物對不同細胞株的抑制率，篩選金安粉敏感作用濃度。 結果：金安粉對肺癌細胞株A549和H446均有不同程度的抑制并呈現(xiàn)一定的濃度和時間依賴性。金安粉200ug/ml、250ug/ml、300ug/ml、350ug/ml、400ug/ml對A54

7、9細胞24小時的抑制率分別為45.3﹪、49.2﹪、55.8﹪、68.7﹪、77.2﹪;金安粉200ug/ml、250ug/ml、300ug/ml、350ug/ml、400ug/ml對H446細胞24小時的抑制率分別為39.6﹪、43.8﹪、49.5﹪、62.3﹪、75.7﹪。肺癌細胞株A549作用24小時的IC50為250ug/ml。金安粉對H446肺癌細胞株24小時的IC50為300ug/ml,金安粉配合化療藥物作用效果最強，抑制率

8、最高可達98.5﹪。 結論：金安粉(200-400ug/ml)對肺癌細胞A549、H446具有增殖抑制作用，且比同劑量任何單一成分的作用明顯，提示各組成單味藥混合在一起具有協(xié)同抑制肺癌細胞小細胞H446和非小細胞A549增殖效應，并且這種抑制增殖作用可作用于兩種病理類型的肺癌細胞，實驗同時表明，金安粉和化療藥物有協(xié)同增效作用。 第二部分金安粉誘導肺癌細胞株A549,H446凋亡的作用 目的：研究金安粉誘導A54

9、9、H446肺癌細胞株的凋亡作用，采用HE染色、激光共聚焦及流式細胞術對凋亡進行觀察并定性定量檢測細胞凋亡。 方法：制備細胞爬片，光鏡下觀察HE染色的A549、H446細胞用藥前后的細胞膜，細胞質及細胞核的變化。流式細胞術定性定量檢測：細胞經(jīng)中藥作用后，制成單細胞懸液，PI及Annexin-V染色后上機檢測凋亡率。激光共聚焦顯微鏡檢測：細胞經(jīng)中藥作用后,PI及Annexin-V染色后，將標記后的標本置于激光共聚焦顯微鏡下觀察，所

10、得圖像通過鏡載攝像系統(tǒng)自動拍照輸入電腦保存。 結果：金安粉200ug/ml、300ug/ml、400ug/ml作用A549、H446細胞，和對照組即未加藥干預的細胞組比較，1.HE染色觀察出現(xiàn)細胞形態(tài)的一些變化，細胞體積縮小，細胞皺縮，染色體凝集，核碎裂，核固縮，附在核膜周邊，呈現(xiàn)細胞凋亡時的形態(tài)學改變。2.流式細胞儀測定：200ug/ml、300ug/ml、400ug/ml濃度干預24h和48h，可看到凋亡細胞群。金安粉處理的

11、A549、H446細胞作用24h時和48h后，A549細胞200ug/ml處理組隨時間的延長，凋亡率由8.61±0.062﹪提高至15.70±0.046﹪；300ug/ml處理組隨時間的延長，凋亡率由16.45±0.016﹪提高至22.34±0.034﹪；400ug/ml處理組隨時間的延長，凋亡率由22.89±0.082提高至36.73±0.032。H446細胞200ug/ml處理組隨時間的延長，凋亡率由9.89±0.035﹪提高至13

12、.58±0.015﹪；300ug/ml處理組隨時間的延長，凋亡率由11.23±0.013﹪提高至19.46±0.053﹪；400ug/ml處理組隨時間的延長，凋亡率由23.76±0.024﹪提高至33.78±0.042﹪。金安粉不同劑量組隨著劑量增加和作用時間的延長，凋亡細胞的數(shù)量明顯增加，方差分析具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，金安粉對A549，H446肺癌細胞株有顯著的誘導凋亡作用；這一作用在細胞水平可以觀察到。3.激光共聚焦掃描顯

13、微鏡觀察出現(xiàn)凋亡早、中、晚期的細胞，其中細胞凋亡早期Annexin-V高染，細胞膜呈綠色熒光，PI低染，細胞核不著色；凋亡中，晚期細胞則Annexin-V和PI均高染，細胞膜呈綠色熒光，細胞核呈紅色熒光；部分細胞的細胞核呈大小不等、形態(tài)不規(guī)則的碎片狀或梅花狀，為典型的細胞凋亡形態(tài)。而對照組處理的A549、H446細胞Annexin-V和PI均低染。 結論：金安粉可誘導肺癌細胞A549、H446凋亡，這一作用有一定的劑量和時間依賴

14、性。 第三部分金安粉誘導肺癌細胞株凋亡與P53、Survivin、caspase-3的表達關系 目的：研究金安粉在誘導肺癌細胞株凋亡過程中對P53、Survivin、caspase-3mRNA和蛋白的表達影響，探討金安粉誘導肺癌細胞株凋亡的分子機制。 方法：肺癌細胞在不同濃度的金安粉作用不同的時間后，離心收集細胞，用Trizol提取液提取細胞總RNA，采用熒光定量RT-PCR的方法，檢測P53、Survivin、

15、caspase-3mRNA的表達。金安粉作用肺癌細胞株后，用免疫組化等方法，檢測P53、Survivin和caspase-3蛋白的表達和定位。 結果：1.金安粉作用肺癌細胞株A549、H446不同時間后，可以看出金安粉對SurvivinmRNA和蛋白的表達有下調作用，并有濃度和時間依賴性。2.金安粉作用A549、H446細胞株不同時間后，金安粉對P53、caspase-3mRNA和蛋白的表達有上調作用，并有濃度和時間依賴性。研究

16、也發(fā)現(xiàn)A549、H446肺癌細胞野生型P53蛋白主要在胞核內表達，金安粉使A549、H446肺癌細胞野生型P53蛋白在胞核內表達增強，表達的強弱與時間與濃度呈正相關，Survivin蛋白在A549、H446肺癌細胞胞漿內有強表達，加用金安粉后，表達下降，表達的強弱與時間與濃度呈負相關。A549、H446肺癌細胞caspase-3蛋白主要在胞漿內表達，金安粉使A549、H446肺癌細胞caspase-3蛋白在胞漿內表達增強，表達的強弱與時