輻射致癌相關(guān)基因篩選及部分相關(guān)基因作用研究.pdf

1、物理、化學(xué)、生物是環(huán)境致癌的三大因素，而電離輻射是最常見的物理致癌因素之一。隨著核能在國民經(jīng)濟和軍事領(lǐng)域中的應(yīng)用越來越廣泛，電離輻射對人類的潛在危害也不斷增加，輻射致癌是最重要的電離輻射遠后效應(yīng)，對輻射致癌分子機理進行研究，是腫瘤學(xué)、放射生物學(xué)、預(yù)防醫(yī)學(xué)與輻射防護學(xué)探討的重點。輻射的致癌效應(yīng)和其它腫瘤的發(fā)生類似，是個極其復(fù)雜的過程，涉及到多個腫瘤相關(guān)基因的改變和功能的異常，諸如p53、p16、AMT、Rb、hRAD50等基因在輻射致癌過

2、程中都有參與。腫瘤相關(guān)基因編碼的產(chǎn)物(蛋白和酶等)參與了轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號傳導(dǎo)、損傷修復(fù)、細胞周期調(diào)控、增殖分裂、能量代謝調(diào)亡等等一系列機體的生物學(xué)行為過程。但是隨著研究的深入，研究者們陷入困惑當(dāng)中：各腫瘤伴發(fā)的相關(guān)基因改變譜隨著種屬、個體、組織類型以及誘因的不同而存在明顯的不同；在細胞惡性轉(zhuǎn)化的各個時期基因的改變也不盡相同；在某個腫瘤的發(fā)生中伴發(fā)的眾多基因的改變中，很難區(qū)別那些基因?qū)δ[瘤的發(fā)生和發(fā)展起重要作用，哪些是腫瘤生成過程中由于DN

3、A修復(fù)異常及基因組的不穩(wěn)定性引起的繼發(fā)性改變。這些原因使腫瘤發(fā)生機理的研究變的異常復(fù)雜，有些問題急待解決：首先需要研究從正常細胞受到輻射后到腫瘤的發(fā)生過程中眾多相關(guān)基因的變化譜；其次是從中挑選出那些在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演了重要角色的基因；此外還需要搞清有哪些新基因在腫瘤發(fā)生過程中起了重要作用。因此，高效的篩選出輻射致癌模型中特異性表達變化的基因并對其功能進行研究就成為研究輻射致癌機理的非常重要的一環(huán)。 基因芯片技術(shù)是近年來

4、發(fā)展起來的一項大規(guī)模篩選腫瘤相關(guān)基因的技術(shù)，具有高效、快速的特點，能在一次實驗中完成成千上萬基因的檢測。自從1996年底stephenfodor博士等人研究的第一塊芯片問世以后，芯片技術(shù)發(fā)展迅速，并且很快就廣泛應(yīng)用于腫瘤的研究上。基因芯片技術(shù)的局限性在于實驗結(jié)果中存在一定的假陽性，另外一個方面就是特異程度不高。對于假陽性問題可以通過增加實驗重復(fù)次數(shù)，使用熒光實時定量PCR技術(shù)等驗證陽性結(jié)果來避免。特異性問題主要是與芯片上所點的EST片段

5、選擇有關(guān)系，要解決這個問題一是制備特定的cDNA文庫自制芯片，而這樣的實驗成本將數(shù)十倍的增加；還有一種辦法是與其它篩選結(jié)果作為相互補充，比如抑制差減雜交(SSH)。SSH也是研究的基因差異表達的最有效工具之一，其依據(jù)的技術(shù)主要是抑制PCR和差減雜交。該方法得到的cDNA群體不僅富集了差異表達的基因，而且目的基因間豐度的差異經(jīng)過均衡化作用已基本消除，特別適用于低豐度克隆的分離。同時該方法具有靈敏度高、重復(fù)性好等特點。該技術(shù)已經(jīng)成為分子生物

6、學(xué)領(lǐng)域研究兩個細胞群體間差異表達基因的有力工具，為研究腫瘤發(fā)生發(fā)展中的基因開關(guān)及表達變化提供了極大的便利，推動了細胞遺傳、生長、分化及癌變等許多領(lǐng)域的研究。在新基因的全長mRNA克隆方面，以核酸雜交技術(shù)為基礎(chǔ)的cDNA文庫篩選一直被認(rèn)為是一種準(zhǔn)確可靠的方法而廣為應(yīng)用。但這種方法存在費時費力等缺點，尤其是在一些情況下并不能得到其對應(yīng)的mRNA全長序列而使其的應(yīng)用受到一定限制。建立在PCR基礎(chǔ)之上的RACE技術(shù)的出現(xiàn)在一定程度上解決了文庫篩

7、選的這些不足之處，尤其是SMARTRACE技術(shù)的發(fā)明，使一般中小實驗室也可以得到一些新的mRNA序列全長。 本研究擬綜合利用基因芯片和SSH方法篩選輻射致癌模型中的差異表達基因，對得到的部分新的EST片段進行全長mRNA克隆。并從中選取部分基因(已知和功能未知的新基因)研究分析其在輻射致癌過程中的作用。從而為輻射致癌機理的進一步深入研究奠定基礎(chǔ)。 研究內(nèi)容和方法： 1.首先以60C0作為輻射源，建立γ射線誘發(fā)的人

8、支氣管上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化的細胞模型，作為為后續(xù)的研究實驗標(biāo)本取材。 2.應(yīng)用基因芯片技術(shù)對輻射誘導(dǎo)的腫瘤模型進行相關(guān)基因篩選：篩選輻射誘導(dǎo)的小鼠胸腺型白血病惡性轉(zhuǎn)化模型的相關(guān)差異表達基因。并對部分差異基因的可能作用進行分析。 3.使用抑制差減雜交方法對輻射誘導(dǎo)的惡性轉(zhuǎn)化細胞模型進行差異表達基因篩選。對得到的差異片段進行測序及生物信息學(xué)分析；對部分篩選出來的表達差異基因使用熒光定量PCR方法檢測并確認(rèn)其變化；將新的EST登錄

9、到GenBank上，并進行初步的生物信息學(xué)分析，選出候選的擴增全長序列。 4.從基因芯片篩選的差異表達基因中選定p16基因，對γ射線誘發(fā)的小鼠白血病模型中p16蛋白表達及基因突變進行相關(guān)研究。 5.應(yīng)周SMARTRACE技術(shù)克隆新的EST序列T54(GenBankID：EB643248)的mRNA全長，對其功能進行生物信息學(xué)的初步分析探討。 研究結(jié)果： 1.細胞輻射誘導(dǎo)的惡性轉(zhuǎn)化模型建立：(1)平板克隆實

10、驗表明在經(jīng)過22Gy照射培養(yǎng)至35代后，其增殖能力明顯增加；(2)血清抗性實驗提示照射組細胞在第45代后克隆形成增加；而在照射后50代細胞軟瓊脂集落的形成能力明顯增加，由對照的2.86‰增加到13.10‰(P＜0.01)。(3)裸鼠致瘤實驗是證明細胞惡性的金標(biāo)準(zhǔn)，在種植22Gy50代的8只裸鼠中，經(jīng)過50天的潛伏期后觀察到一只裸鼠的頸背部形成腫瘤，22Gy60代的8只裸鼠中有4只裸鼠成瘤，由此判斷細胞發(fā)生明確惡性轉(zhuǎn)化。病理切片及免疫組化

11、證實為上皮細胞癌。 2.基因芯片的實驗結(jié)果：腫瘤組與對照組相比差異在3倍以上的基因共有319條，表達上升的111條，下降的208條。其中已報道功能基因為147條，另外172條基因為功能未報道的基因片段。 3.成功的利用抑制差減雜交方法建立了惡性轉(zhuǎn)化細胞模型差異表達cDNA文庫：利用通用引物擴增后，根據(jù)插入片段長度不同，從表達上升和下降的文庫中各選取40個有代表性的克隆進行測序。在80個進行測序的克隆中，得到確定序列的共7

12、3個。在轉(zhuǎn)化細胞中表達下降的序列41條，Blast比較分析結(jié)果：得到已知序列6條；未知基因的EST序列20條；空載體序列7條；8條為重復(fù)測定序列。在轉(zhuǎn)化細胞中表達上升的序列32條，Blast分析：已知序列14條；未知基因的EST序列9條；重復(fù)測定的序列9條。將得到的29個未知序列登錄到GenBank，序列ID：(EB643220、EB643221、EB643222……EB643248)。對其中的部分基因改變進行熒光定量PCR檢測，結(jié)果表

13、明輻射轉(zhuǎn)化組中MY06、HACE1、ZNF143、HNRPH1的表達量明顯增加(與對照組相比，轉(zhuǎn)化組中的mRNA分別增加了3.49倍、29.38倍、12.99倍、5.00倍)；而PCBP2、RPL15、TCERG1的表達量下降(與對照組相比，轉(zhuǎn)化組中的mRNA分別減少了1.89，48.77，11.95倍)。 4.基因芯片結(jié)果提示p16在輻射誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生中表達下降，對p16基因表達下降的原因進行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)白血病模

14、型中p16基因外顯子2有13例發(fā)生缺失，缺失率為33.3％；(2)有9例發(fā)生了外顯子1啟動區(qū)域的甲基化，發(fā)生率為23.1％。(3)無一例發(fā)現(xiàn)堿基突變的發(fā)生。(4)p16蛋白表達下降比例約為52.4％。 5.克隆了一條新的全長基因Lcrp369。經(jīng)對其進行初步的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該基因是位于染色體14p22號臂上的一條功能尚不清楚的基因。其編碼區(qū)域由7個外顯子和6個內(nèi)含子組成，mRNA全長1038bp，具有一個21bp的PolyA

15、“尾巴”，編碼一條長244個氨基酸的蛋白，蛋白位于細胞核內(nèi)，具有DNA結(jié)合位點及N-糖基化位點、依賴于cAMP/cGMP的蛋白激酶磷酸化作用位點、酪蛋白激酶磷酸化位點和到N-豆蔻?；稽c。該蛋白二級結(jié)構(gòu)推測為α螺旋蛋白，其分子量為28Kd，等電點為6.19。數(shù)字化組織表達譜系分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該基因表達廣泛，可在多個組織中表達及在多種腫瘤中表達。該基因全長已經(jīng)登錄到GENBANK上，ID號DQ525179。 結(jié)論： 1.成功

16、的建立了輻射誘導(dǎo)的支氣管上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化模型，為輻射致癌發(fā)生的分子機制研究提供了實驗取材基礎(chǔ)。 2.基因芯片和抑制差減測序結(jié)果表明，輻射致癌過程是個十分復(fù)雜的多步驟過程，涉及到眾多基因的參與，其中許多基因為新基因，其功能并不為人所知。表達顯著改變的已報道基因(差異在3倍以上)按其功能可分成以下幾類：原癌基因和抑癌基因；與信號傳導(dǎo)有關(guān)基因；細胞周期相關(guān)基因；DNA結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)錄起始因子；細胞表面抗原和粘附分子基因；代謝相關(guān)的酶和激

17、酶基因；免疫球蛋白基因；DNA合成、修復(fù)和重組蛋白類基因；細胞骨架蛋白；其它基因。對這些基因尤其是新基因的研究將有助于對腫瘤發(fā)生機制的認(rèn)識和了解。 3.輻射誘發(fā)的腫瘤中p16蛋白含量降低，p16基因表達下降主要由外顯子2缺失及啟動子區(qū)域甲基化引起。p16蛋白表達下降參與了輻射誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生，并可能是輻射誘導(dǎo)致癌的中、晚期事件。 4.生物信息學(xué)的初步分析結(jié)果表明：新基因Lcrp369可在多個正常組織中及多種腫瘤組織中表達，其