以精胺為基本構(gòu)建單元并可降解為精胺的聚陽(yáng)離子基因載體的研究.pdf

1、為了構(gòu)建安全有效的基因載體，我們用體內(nèi)天然存在的專(zhuān)職基因凝聚單體一精胺作為基本構(gòu)建單元，合成了一類(lèi)能夠并實(shí)現(xiàn)基因復(fù)合、內(nèi)吞逃逸、基因釋放和自身無(wú)毒化代謝，并且可通過(guò)表面修飾進(jìn)一步兼顧體內(nèi)循環(huán)和細(xì)胞靶向的聚陽(yáng)離子基因載體。這一類(lèi)聚陽(yáng)離子的特點(diǎn)包括：有足夠的質(zhì)子化氨基形成高密度的正電荷以凝聚帶有負(fù)電荷的基因物質(zhì)；能夠通過(guò)降解回到精胺的初始內(nèi)源性狀態(tài)完成自身的無(wú)毒化代謝(因?yàn)榫坳?yáng)離子均有化學(xué)毒性)，釋放其所凝聚的基因物質(zhì)，甚至通過(guò)所釋放的精胺

2、的游離氨基協(xié)助基因的內(nèi)吞逃逸。
　　 首先，我們將精胺的四個(gè)氨基中的兩個(gè)伯胺基選擇性保護(hù)后，分別與乙二醇二氯甲酸酯和琥珀酰氯反應(yīng)聚合成含有氨酯和酰胺結(jié)構(gòu)的聚陽(yáng)離子，然后進(jìn)行脫保護(hù)置換出伯胺基，經(jīng)透析去除小分子雜質(zhì)得到所需分子量的聚陽(yáng)離子。我們分別命名兩個(gè)聚陽(yáng)離子為Polycarbam-SP和Polyamide-SP。另外，利用乙二醛與未保護(hù)的精胺的兩個(gè)伯胺反應(yīng)，合成了通過(guò)碳氮雙鍵聚合，并經(jīng)透析純化得到另一個(gè)聚陽(yáng)離子(命名為Pol

3、ymine-SP)。我們統(tǒng)稱(chēng)精胺作為骨架的基本構(gòu)建單元的聚陽(yáng)離子為Polylink-SP。若在Polylink-SP合成前，對(duì)精胺結(jié)構(gòu)的一端進(jìn)行PEG化，則可容易地制備端頭PEG化的PEG-Polylink-SP。
　　 鑒于聚陽(yáng)離子的降解在基因輸送過(guò)程中的功能，我們考察了三種Polylink-SP在37℃下，pH=7.4的緩沖溶液中的水解速率，其中Polycarbam-SP(含氨酯鍵)和Polyamide-SP(含酰胺鍵)的降

4、解速率較慢,14天后聚合物的平均分子量分別降至66％和34％。而Polymine-SP(含碳氮雙鍵)十幾個(gè)小時(shí)內(nèi)即可以大部降解。
　　 聚陽(yáng)離子基因載體可以通過(guò)靜電作用與質(zhì)粒形成復(fù)合物。我們通過(guò)凝膠電泳、動(dòng)態(tài)光散射和ζ電位實(shí)驗(yàn)檢測(cè)考察了上述三種Polylink-SP凝聚基因物質(zhì)形成納米顆粒(Polyplex)的能力。在凝膠電泳上，通過(guò)氨酯和酰胺鍵連接的聚陽(yáng)離子(Polycarbam-SP和Polyamide-SP)與DNA質(zhì)粒的

5、質(zhì)量比達(dá)到3時(shí)，DNA的遷移帶完全消失，說(shuō)明DNA已被可聚陽(yáng)離子完全凝聚。通過(guò)碳氮雙鍵連接的聚陽(yáng)離子(Polymine-SP)在質(zhì)量比為1時(shí)，DNA在電泳上的遷移就完全消失。這可能部分地由于Polyimine-SP的氨基密度(單位質(zhì)量擁有的氨基)大于另外兩個(gè)聚陽(yáng)離子1.4倍，部分地由于Polymine-SP的分子量更大。質(zhì)量比3-12之間時(shí)，上述三種聚陽(yáng)離子與基因形成的復(fù)合物的粒徑都在200nm以下，電勢(shì)在40mV或30mV以下，這些特

6、性表明該類(lèi)聚合物能夠有效地將基因凝聚成納米顆粒。
　　 更為重要的是這些Polylink-SP系列的聚陽(yáng)離子用于基因轉(zhuǎn)染時(shí)顯示了與常用基因轉(zhuǎn)染試劑(只能作為實(shí)驗(yàn)試劑而因毒性不能走向臨床的聚陽(yáng)離子)相當(dāng)或更好的生物活性。Polycarbam-SP和Polyamide-SP用于熒光素酶和綠色熒光蛋白兩種報(bào)告基因在COS-7和293ft細(xì)胞中的表達(dá)時(shí)，其效率與陽(yáng)性對(duì)照組——分子量為25kDa的Polyethylenimine(PEI-

7、25KDa)相當(dāng)。而Polymine-SP在最佳聚陽(yáng)離子/基因質(zhì)量為7時(shí)，對(duì)相同報(bào)告基因的COS-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率比陽(yáng)性對(duì)照組高出一個(gè)數(shù)量級(jí)。同樣有意義的是Polylink-SP系列的聚陽(yáng)離子對(duì)于COS-7細(xì)胞的毒性均低于PEI-25KDa，特別是其中基因轉(zhuǎn)染活性最高的Polyimine-SP的細(xì)胞毒性是其中最低的。這一結(jié)果(雖然還有待更多的重復(fù)實(shí)驗(yàn)確認(rèn))初步支持了我們?cè)O(shè)計(jì)思路，即聚陽(yáng)離子的適時(shí)降解同時(shí)完成了兩個(gè)有意義的動(dòng)作：基因物質(zhì)在細(xì)

8、胞中的釋放及聚陽(yáng)離子本身在細(xì)胞中的代謝。
　　 與其它聚陽(yáng)離子基因載體一樣，對(duì)Polylink-SP系列進(jìn)行PEG化，進(jìn)一步降低了細(xì)胞毒性，有些聚陽(yáng)離子在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)幾乎沒(méi)有顯示出細(xì)胞毒性。另外，熒光探針示蹤實(shí)驗(yàn)表明，Polylink-SP系列的聚陽(yáng)離子與熒光基因形成的納米顆粒(Polyplex)附著在細(xì)胞核表面，證明了載體的內(nèi)吞逃逸效益。siRNA基因沉默實(shí)驗(yàn)中，聚合物也顯示出較高的基因沉默作用。
　　 作為總結(jié)，我們利