用精胺修飾家蠶絲素及其作為基因傳遞載體.pdf

1、促進三維支架內(nèi)血管網(wǎng)絡(luò)的生成是引導(dǎo)皮膚真皮組織再生的關(guān)鍵問題。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和血管生成素（Ang-1）是兩種最重要的是僅以血管內(nèi)皮細胞為靶細胞的促血管再生生長因子，但生長因子的半衰期短。尋找合適的載體將生長因子的基因包被、壓縮后，載入真皮再生支架內(nèi)，使外源性基因原位轉(zhuǎn)染細胞，細胞穩(wěn)定、高效地表達相應(yīng)的促血管生長因子，刺激血管的再生，是加快真皮再生支架內(nèi)血管網(wǎng)絡(luò)的生成速度、促進真皮組織再生的途徑。家蠶絲素蛋白（BSF）具有良

2、好的生物相容性，可被生物降解性，含有一定數(shù)量的極性氨基酸殘基可以作為化學反應(yīng)活性位點，通過化學修飾使其表面帶負電荷翻轉(zhuǎn)成帶正電荷，可能作為促血管再生因子的基因載體，用于促進真皮再生支架內(nèi)的血管網(wǎng)絡(luò)再生。
　　本文用精胺對絲素蛋白化學修飾，使絲素蛋白表面帶負電荷翻轉(zhuǎn)為正電荷，建立絲素蛋白的陽離子化技術(shù)；然后用陽離子化絲素蛋白（CMBSF）和聚乙烯亞胺（PEI）聯(lián)合包被含VEGF和Ang-1編碼的質(zhì)粒基因（pDNA）形成復(fù)合物，保護、

3、壓縮pDNA并使其表面帶正電荷，建立VEGF165-Ang-1雙基因共表達質(zhì)粒的傳遞載體新技術(shù)。在體外，一方面轉(zhuǎn)染EA.hy926細胞，研究包被pDNA的方式對基因轉(zhuǎn)染效果和細胞毒性的影響；另一方面，將復(fù)合物裝載在絲素支架內(nèi)，通過雞胚絨毛尿囊膜血管形成實驗，研究包被pDNA的方式對轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細胞的效果，促進血管網(wǎng)絡(luò)生成的影響。在體內(nèi)，將質(zhì)粒復(fù)合物裝載在多孔絲素支架內(nèi)后，植入SD大鼠背部真皮缺損創(chuàng)面，研究載體內(nèi)pDNA是否能夠原位轉(zhuǎn)染創(chuàng)面細

4、胞，促進絲素支架內(nèi)血管網(wǎng)絡(luò)的形成、促進創(chuàng)面真皮組織的再生。
　　首先，精胺對家蠶絲素蛋白陽離子化改性，由碳化二亞胺（EDC）/N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）激活家蠶絲素蛋白側(cè)鏈上的-COOH，可以將帶正電荷的精胺上偶合于絲素蛋白的側(cè)鏈。經(jīng)精胺修飾的絲素蛋白表面的zeta電位由負值變?yōu)檎?，其等電點由4.20變?yōu)?.04。其次，探究包被pDNA的方式對EA.hy926細胞體外轉(zhuǎn)染的影響，通過激光共聚焦顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)與P

5、EI/pDNA復(fù)合物相比，（CMBSF+PEI）/pDNA和CMBSF/BSF/PEI/pDNA復(fù)合物對EA.hy926細胞的轉(zhuǎn)染（24 h）明顯較好，且細胞的形態(tài)變好，細胞核縮現(xiàn)象明顯減弱，CCK-8試劑測試細胞活力提高。此外研究（CMBSF+PEI）/pDNA和 CMBSF/BSF/PEI/pDNA復(fù)合物對雞胚絨毛尿囊膜血管生成的作用，通過圖片觀察得出，與空白絲素支架組、PEI/pDNA組相比，裝載（CMBSF+PEI）/pDNA和

6、 CMBSF/BSF/PEI/pDNA復(fù)合物的多孔絲素蛋白支架上布滿了豐滿旺盛的血管，血管呈現(xiàn)放射葉脈狀，通過Image-Pro Plus軟件分析支架內(nèi)的血管新生面積率明顯增多。
　　最后，裝載VEGF165-Ang-1pDNA復(fù)合物對真皮再生支架血管生成的影響，通過組織學觀察和Image-Pro Plus圖像分析軟件得出，在植入體內(nèi)1周時，與空白支架組相比，含質(zhì)粒復(fù)合物的支絲素架上新生組織率、促血管生長因子的陽性表達率沒有顯著性

7、差異；而在植入體內(nèi)2周時，與空白支架組相比，含質(zhì)粒復(fù)合物的支架上新生組織率、新生微血管密度和VEGF、Ang-1和PDGF生長因子的陽性表達率均有顯著性差異；在植入體內(nèi)4周時，含質(zhì)粒復(fù)合物的支架上新生組織率明顯提高，膠原纖維化，而新生微血管密度和VEGF、Ang-1和PDGF生長因子的陽性表達率均明顯減少，絲素支架基本上降解，新生組織幾乎填充絲素支架的空隙結(jié)構(gòu)。說明含質(zhì)粒復(fù)合物的支架植入體內(nèi)有利于新生血管、新生組織的生長，加快真皮缺損部

8、位的修復(fù)。
　　本文首次用精胺對家蠶絲素蛋白化學修飾，使絲素蛋白陽離子化。系統(tǒng)地探究（CMBSF+PEI）/pDNA復(fù)合物和CMBSF/BSF/PEI/pDNA復(fù)合物分別對EA.hy926細胞轉(zhuǎn)染情況和細胞毒性的影響，首次研究將這兩類含VEGF165-Ang-1雙基因復(fù)合物裝載在多孔絲素支架上對細胞轉(zhuǎn)染的情況、促血管的生長及真皮組織缺損修復(fù)的影響。研究得出（10μg CMBSF+5μg PEI）/2μg pDNA復(fù)合物和20μg