EBV相關(guān)淋巴瘤動(dòng)物模型的差異表達(dá)基因篩選.pdf

1、目的：檢測(cè)分析Scid小鼠體內(nèi)EBV相關(guān)淋巴瘤和正常人淋巴細(xì)胞兩者宿主細(xì)胞的差異表達(dá)基因，篩選EBV誘發(fā)淋巴瘤的候選關(guān)鍵基因，探討EBV相關(guān)淋巴瘤發(fā)生的可能分子機(jī)制。
　　方法：采集健康獻(xiàn)血員新鮮血液樣本，分離出人淋巴細(xì)胞，分別保存正常淋巴細(xì)胞，復(fù)制 Scid小鼠體內(nèi) EBV相關(guān)淋巴瘤模型。采用4×44K的Agilent人類全基因組表達(dá)譜芯片進(jìn)行檢測(cè)，分析Scid小鼠體內(nèi)EBV相關(guān)淋巴瘤和正常人淋巴細(xì)胞的差異表達(dá)基因，篩選出fol

2、d change≥2的基因?yàn)楸磉_(dá)顯著上調(diào)基因，F(xiàn)old change≤0.5為表達(dá)顯著下調(diào)基因。運(yùn)用GO分類、KEGG代謝通路、Biocarta和Reactom調(diào)控通路及DAVID在線軟件對(duì)差異基因進(jìn)行功能聚類及通路分析，并結(jié)合STRING、Cytscape分析差異基因的相互作用，預(yù)測(cè)差異基因的生物學(xué)功能。
　　結(jié)果：
　　1、病理學(xué)診斷Scid小鼠體內(nèi)誘發(fā)腫瘤為彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤，且PCR證實(shí)此淋巴瘤為人源性，成功復(fù)制體內(nèi)

3、EBV相關(guān)淋巴瘤實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?例樣本標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)均采用LIMMA、BRB-Random Variance Model、SAM軟件篩選差異表達(dá)基因，以PDR<0.001共篩選出差異表達(dá)探針3928個(gè)。將未映射到HUGO的Probe剔除，再選取fold-change2倍變化視為表達(dá)差異顯著，共篩選出202個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因44個(gè)，下調(diào)基因158個(gè)，系統(tǒng)構(gòu)建了6例同源EBV相關(guān)淋巴瘤（T）和正常淋巴細(xì)胞（N）的差異基因表達(dá)譜。
　

4、　2．差異表達(dá)基因的生物信息學(xué)分析
　　Gene Ontology分類的BP分析顯示，共30個(gè)上調(diào)基因參與27個(gè)BP分類，其中與細(xì)胞周期和有絲分裂相關(guān)的“cell cycle”,“cell cycle phase”,“nuclear division”,“mitosis”,“M phase of mitotic cell cycle”,“cell cycle process”,“organelle fission”,“M phas

5、e”和“mitotic cell cycle”等10個(gè)GO BP分類的EASE score最低，均<2.6E-09。上調(diào)基因CDC6, KIFC1, OIP5, NCAPG, KIF15, BUB1, CDCA2, AURKA, CEP55, PBK參與多個(gè)與細(xì)胞周期相關(guān)的生物過(guò)程。126個(gè)下調(diào)基因參與116個(gè)BP分類，其中“inflammatory response”,“response to wounding”,“immune re

6、sponse”,“defense response”,“taxis”,“chemotaxis”,“regulation of secretion”,“behavior”,“anti-apoptosis”和“protein kinase cascade”的EASE Score得分最低，均<1.6E-04。下調(diào)基因CSF2, CCL2, CXCL5, CXCL2, TLR2, FCN1, LILRA5, IL1RAP, IL1B, THBS

7、1, CFD, PTX3, FCGR3A, IL1A, IL1RN等主要與細(xì)胞損傷、炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答等生物學(xué)過(guò)程相關(guān)。
　　25個(gè)上調(diào)基因參與13個(gè)MF分類，其中主要涉及核酸結(jié)合活性，如“ATP binding”,“adenyl ribonucleotide binding”,“adenyl nucleotide binding”,“purine nucleoside binding”和“nucleoside binding”的

8、EASE Score得分最低，均<0.006。參與多個(gè)分子功能的基因有 CDC6, KIFC1, KIF15, BUB1, AURKA, PBK,TOP2A, GSG2, RAD51。123個(gè)下調(diào)基因參與12個(gè)MF分類，其中主要涉及分子信號(hào)與細(xì)胞因子受體結(jié)合，如“carbohydrate binding”,“cytokine binding”,“polysaccharide binding”,“protein binding”和“gly

9、cosaminoglycan binding”,“cytokine activity”,“interleukin-1 receptor binding”的EASE Score的得分最低，均<0.001。參與多種分子功能的基因有SELP, TNFAIP6, CCL2, C6ORF25, TLR2, PTX3, THBS1, NLRP3, IL1RN, IL1B, IL1A。
　　利用“KEGG Pathway”,“BioCarta”

10、和“Reactome”進(jìn)行Pathway分析顯示，當(dāng)EASE Score<0.05時(shí)，上調(diào)基因中不參與“KEGG-pathway”，2個(gè)基因參與1條“BioCarta-pathway”，5個(gè)基因參與1條“Reactome-pathway”；下調(diào)基因中64個(gè)基因參與7條“KEGG-pathway”，30個(gè)基因參與1條“BioCarta-pathway”，33個(gè)基因參與2條“Reactome-pathway”。
　　將上調(diào)和下調(diào)差異表

11、達(dá)基因涉及的生物學(xué)功能進(jìn)行“Functional Annotation Clustering”分析，結(jié)果顯示上調(diào)基因涉及的生物學(xué)功能分類聚成15個(gè)集合，其中富集分?jǐn)?shù)最高的功能集合主要涉及細(xì)胞周期和細(xì)胞分裂；下調(diào)基因涉及的生物學(xué)功能分類聚成63個(gè)集合，富集分?jǐn)?shù)最高的功能集合主要涉及細(xì)胞趨向性、細(xì)胞成分及蛋白、多糖結(jié)合活性。
　　利用STRING、Cytoscape、PATHWAY及GO分類等生物信息學(xué)軟件綜合分析202個(gè)差異表達(dá)基因

12、（上調(diào)44個(gè)，下調(diào)158個(gè)），對(duì)此202個(gè)基因進(jìn)行生物學(xué)功能分析及預(yù)測(cè)，上調(diào)基因CDC6, KIFC1, OIP5, NCAPG, KIF15, BUB1, CDCA2, AURKA, CEP55, PBK等主要參與細(xì)胞周期、有絲分裂等生物學(xué)過(guò)程；上調(diào)基因TNFRSF13B, TNFRSF17, CXCL9，下調(diào)基因CSF2, CCL2, FOS, EGF, IL1A, IL1B, DUSP6等則與腫瘤相關(guān)信號(hào)通路密切相關(guān)，如Infla

13、mmation，Angiogenesis，MAPK signal pathway，Adherens junction，NOD-like receptor signaling pathway等；下調(diào)基因CSF2, CCL2, CXCL5, CXCL2, TLR2, FCN1, LILRA5, IL1RAP, IL1B, THBS1, CFD、PTX3, FCGR3A, IL1A, IL1RN等主要與細(xì)胞損傷、炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答等生物學(xué)過(guò)程

14、相關(guān)，如“response to wounding”,“inflammatory response”,“immune response”。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合上述多種生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，15個(gè)差異表達(dá)基因在蛋白網(wǎng)絡(luò)中處于中心位置，包括EGF, IL1B, PBK, CSF2, TLR2, DUSP6, HDC, CD68, TREM1, IL1A, CCL2, SPI1, PLAU, TGFB1和FOS，其中EGF, IL1B, PBK, C

15、SF2, TLR2這5個(gè)基因在度數(shù)和介度中的排名均靠前，我們推測(cè)EGF, IL1B, PBK, CSF2和TLR2可能是導(dǎo)致EBV相關(guān)淋巴瘤發(fā)生的關(guān)鍵分子。
　　3.綜合信號(hào)通路、基因生物學(xué)分類、基因間相互作用分析及已有文獻(xiàn)報(bào)道，提示EBV可能上調(diào)宿主細(xì)胞PBK基因促進(jìn)細(xì)胞增殖，下調(diào)宿主細(xì)胞EGF基因發(fā)揮抗凋亡作用，下調(diào)宿主細(xì)胞IL1β, CSF2, TLR2基因等降低細(xì)胞免疫能力，從而導(dǎo)致EBV相關(guān)淋巴瘤的發(fā)生。
　　結(jié)論