中國結(jié)核分枝桿菌群體基因組的分析.pdf

1、結(jié)核分枝桿菌作為結(jié)核病的病原菌，自上世紀(jì)五十年代以來，不斷發(fā)現(xiàn)有效的抗結(jié)核菌藥物，使古老的結(jié)核病流行得到了一定的控制，但是由于不少國家對結(jié)核病的忽視，艾滋病的并發(fā)感染和抗生素的濫用等，結(jié)核病死灰復(fù)燃。在中國、印度等地出現(xiàn)了越來越多的耐藥結(jié)核分枝桿菌，作為中國盛行的lineage2型別也被認(rèn)為具有更強(qiáng)耐藥性、更強(qiáng)毒力的現(xiàn)代型結(jié)核菌，這也使得對結(jié)核流行病學(xué)的、耐藥相關(guān)的、lineage2型別相關(guān)的研究成為關(guān)注熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)室通過在中國地區(qū)廣泛

2、的收集臨床耐藥結(jié)核菌株等，運(yùn)用高通量二代全基因組測序，對161株結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行生物信息分析，從基因組水平挖掘結(jié)核分枝桿菌的進(jìn)化過程、型別特征和耐藥相關(guān)區(qū)域等。本研究的主要結(jié)果如下：
　　1.通過與NCBI數(shù)據(jù)庫中22株已知分型的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定了收集的161株中國臨床菌株分別屬于lineage2(122株)、lineage3(2株)和lineage4(37株)。在群體結(jié)構(gòu)方面重點(diǎn)對主要流行的lineage2

3、和lineage4展開分析，從分類比較菌株中突變位點(diǎn)數(shù)量發(fā)現(xiàn)，結(jié)核菌株型別間的差異要比耐藥與敏感菌株間的差異要更具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即不同型別間存在明顯的突變位點(diǎn)數(shù)量的差異。
　　2.基于推測的祖先序列，統(tǒng)計(jì)屬于lineage2型別相關(guān)的位點(diǎn)為295個(gè)，lineage4型別相關(guān)的突變位點(diǎn)為167個(gè)。從G:C>T:A的顛換與G:C>A: T轉(zhuǎn)換的比值中得知，屬于lineage2型別相關(guān)的SNPs為氧化損傷導(dǎo)致的突變比例較lineage4

4、要大，而氧化損傷又被報(bào)道同結(jié)核菌的耐藥性相關(guān)，因此lineage2基因組易發(fā)生氧化損傷的突變也為lineage2易突變和易耐藥的原因提供條可能線索。另外，我們發(fā)現(xiàn)，相對于lineage4型別相關(guān)nsSNPs，lineage2型別相關(guān)的nsSNPs存在一定數(shù)量的影響復(fù)制，重組和修復(fù)相關(guān)的和轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白功能的非同義突變(如recD，Rv0922，dinG，uvrC和nth等)，這類突變正好也可以用來作為解釋lineage2相較于lineag

5、e4的易突變和耐多藥性的潛在突變機(jī)制。因此，這兩者型別相關(guān)的突變位點(diǎn)除了可作為將來高分辨率分型技術(shù)的分子標(biāo)記，對于研究lineage2的易耐藥性、較高突變率和毒力具有一定的價(jià)值。
　　3.在依據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹推測結(jié)核分枝桿菌的起源和進(jìn)化史時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的分化過程同現(xiàn)代人類的遷徙有著密切的聯(lián)系。追蹤結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的共同祖先，同樣是七萬年前左右走出非洲，并依此分化非洲分枝lineage5-6(6萬年前左右)，環(huán)印度洋分

6、枝 lineage1(5.8萬年前左右)、歐美分枝lineage4(3.7萬年前左右)，并最終3.4萬年前左右分化出中亞分枝lineage3和東亞分枝lineage2。
　　4.研究我國主要型別lineage2和lineage4在中國境內(nèi)的可能歷史傳播軌跡時(shí)，我們推測亞型L2.1、L2.2、L2.3和L4.1、L4.2均是在一萬年前左右(新石器時(shí)代)發(fā)生了擴(kuò)張和分化出來。其中，L2亞型中相對古老的L2.1很可能同東亞人早期的“南線

7、”從中國的南部地區(qū)出現(xiàn)有南至北的傳播。而 L2.2、L2.3、L4.1和L4.2更可能與東亞人的“北線”遷徙路徑有關(guān)，從中亞或西伯利亞等區(qū)域傳入中國并擴(kuò)散，尤其是最“年輕”的L2.3的共同祖先(5.2千年前-1萬年前)很可能由于所處的年代(華夏五千年)或本身的進(jìn)化優(yōu)勢(更強(qiáng)的毒力、適應(yīng)性)，使L2.3成為如今中國地區(qū)的主要流行的型別。
　　5.在對臨床結(jié)核分枝桿菌的耐藥關(guān)聯(lián)分析中，首先根據(jù)進(jìn)化樹去除與系統(tǒng)發(fā)育樹相關(guān)的或者是發(fā)生同義

8、突變的SNPs，然后通過泊松分布(P<0.05)和正態(tài)分布(P<0.01)計(jì)算，從剩余的突變基因/間隔區(qū)中篩選得到一批多突變位點(diǎn)、耐藥菌株中突變比率高的候選耐藥相關(guān)基因(85個(gè))/間隔區(qū)(32個(gè))，其中包含已知報(bào)道過的14個(gè)耐藥相關(guān)基因和4個(gè)耐藥相關(guān)間隔區(qū)。由于臨床上有聯(lián)合用藥的習(xí)慣，初步統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)該藥物與藥物之間的關(guān)聯(lián)造成突變頻率高的那些已知耐藥基因與八種藥物都表現(xiàn)出一定關(guān)聯(lián)性，造成關(guān)聯(lián)分析的干擾。
　　6.針對已知報(bào)道耐藥基

9、因的進(jìn)一步相關(guān)性分析(OR值和Fisher精確檢驗(yàn))發(fā)現(xiàn)，生長必需基因突變位點(diǎn)具有一定的偏好性，如rpoB的密碼子531和526突變，katG的315突變，這類集中突變的位點(diǎn)很可能是因?yàn)閷ιL必需基因帶來的影響小，帶給菌株的適應(yīng)性代價(jià)低。相比之下，非必需基因ethA、pncA則表現(xiàn)為耐藥菌株中突變的位點(diǎn)較分散、種類多，無明顯的特異突變位點(diǎn)；已知報(bào)道的inhA和furA基因本身的突變則與異煙肼的耐藥性關(guān)聯(lián)性較弱，然而與異煙肼結(jié)構(gòu)上類似的乙

10、硫異煙胺的耐藥性則與inhA基因和ethA基因的突變表現(xiàn)出了強(qiáng)關(guān)聯(lián)性；作為同樣作用于蛋白質(zhì)合成的一線藥物鏈霉素和二線藥物卷曲霉素、卡那霉素相關(guān)的耐藥基因則所差異，耐鏈霉素的菌株以rpsL的突變?yōu)橹?，而編碼核糖體16S rRNA的rrs上1400位置的突變則更容易導(dǎo)致卷曲霉素和卡那霉素的耐藥性；embA和gyrB則分別在乙胺丁醇和氧氟沙星中耐藥性關(guān)聯(lián)遠(yuǎn)不如embB和gyrA強(qiáng)。
　　7.在挖掘候選耐藥相關(guān)基因與藥物之間的關(guān)系中發(fā)現(xiàn)，

11、基因水平與耐藥機(jī)制的關(guān)聯(lián)性要比原本認(rèn)為的要復(fù)雜，基于STITCH數(shù)據(jù)庫分析，除去已知報(bào)道的直接藥物靶基因突變，還包括間接的耐藥補(bǔ)償相關(guān)、細(xì)胞壁相關(guān)通路(fadD，pks和mmpL家族等)的基因；利用dN/dS分類計(jì)算，發(fā)現(xiàn)候選的耐藥相關(guān)基因在耐藥菌株中受到強(qiáng)烈的正向選擇(平均dN/dS>1.0，其中敏感菌株的全基因組平均dN/dS僅0.430)；85個(gè)候選耐藥基因中含24個(gè)結(jié)核分枝桿菌生長必需基因，這也很可能與長期的藥物刺激和強(qiáng)烈正向選

12、擇壓力有關(guān)；耐藥的候選間隔區(qū)存在通過sRNA或者新的啟動(dòng)子區(qū)域突變來進(jìn)行調(diào)控基因表達(dá)的可能。
　　綜上所述，本研究通過整合中國地區(qū)臨床菌株的測序結(jié)果，找到lineage2與lineage4型別相關(guān)的SNPs和一批耐藥候選區(qū)域，展示了結(jié)核菌同人類長期共進(jìn)化、遷徙的關(guān)系以及在中國的歷史傳播軌跡，挖掘了一些新結(jié)核分枝桿菌的可能耐藥機(jī)制。本研究為更好預(yù)測結(jié)核未來的可能傳播模式并制定防控、跟蹤、診斷和治療方案提供幫助，同樣也為多組學(xué)的結(jié)核分