miR-505轉基因小鼠基因表達量的檢測及生理性狀的觀測.pdf

1、性發(fā)育(puberty)是哺乳動物個體性成熟并獲得生殖能力的過程，受到遺傳、環(huán)境等多種因素的影響。下丘腦-垂體-性腺軸系統(tǒng)控制著人類生殖系統(tǒng)的發(fā)育、成熟及功能的維持，對哺乳動物性發(fā)育起著決定性的作用，其所分泌的各種激素水平直接影響或控制青春期發(fā)育。在正常情況下，人類生長發(fā)育到一定時期時，隨著下丘腦—垂體—性腺軸(HPGA)的成熟，啟動青春期的發(fā)育，但其確切的分子機制尚不明確。
　　近年來，很多人利用小鼠對性發(fā)育機制進行研究。本實驗

2、室從2004年開始，從400多種近交品系小鼠品系中，篩選出兩個性發(fā)育啟動時間有明顯差異，全基因組及線粒體背景已知的近交品系小鼠C3H/HeJ和C57BL/6J作為親本雜交產生F2代，全基因組STR掃描和遺傳分析結果顯示，在6號、13號和X染色體得到了與雌鼠陰門開啟時間相關的區(qū)段，其中X染色體上的～25cM(DXMit103-DXMit119，LOD=3.86)的QTL區(qū)段是顯著相關且首次發(fā)現(xiàn)的，遺傳效應為C57BL/6J顯性、C3H/H

3、eJ隱性。針對小鼠X染色體初步定位的QTL區(qū)段構建數(shù)個特異性區(qū)段同類系，利用STR和SNP位標進行基因分型，并結合表型鑒定，在N7代家系中將小鼠性發(fā)育QTL區(qū)段縮短到X染色體rs13483770-rs29055848之間1cM的范圍內，最終將候選基因定位在了miR-505。
　　miR-505是非編碼的內源性小分子RNA，初級體只有90bp，成熟體有兩種狀態(tài)，分別為miR-505-3P和miR-505-5P。其能在轉錄后水平負性調

4、節(jié)靶mRNA表達。在正常狀態(tài)下，miR-505-5P在RNA水平的表達量高于miR-505-3P。
　　本課題組為深入研究miR-505對性發(fā)育的影響，構建了全cDNA的轉基因小鼠。
　　本研究基于stem-loop逆轉錄引物建立實時定量PCR技術檢測成熟的miRNA;和基于絕對定量法的qRT-PCR檢測microRNA的前體和初級體。Stem-loop qRT-PCR通過改進的莖環(huán)引物逆轉錄方案，采用相對定量的方法對樣本進

5、行分析。用以檢測前體和初級的qRT-PCR方案，采用絕對定量的分析方法，分別檢測出前體和初級體的初始拷貝數(shù)。利用該技術檢測miR-505在轉基因小鼠及其對照品系C57BL/6J中在5、15、25、35四個不同日齡下，丘腦、垂體、卵巢、肌肉、脂肪五個不同組織中miR-505表達水平的差異，結果顯示:在不同日齡不同組織中，pri-miR-505的表達量都非常地低，只有幾十拷貝;但是在5和15日齡下，pre-miR-505初始拷貝數(shù)在轉基因小

6、鼠不同組織中均比C57BL/6J高約10多倍。在成熟狀態(tài)下，miR-505-5P除丘腦組織外，在垂體、卵巢、肌肉和脂肪組織中，其相對表達量基本上都大于1，尤其在卵巢和脂肪組織中，在5和15天日齡下，其相對表達量更是高達4左右。miR-505-3P其在位于性發(fā)育軸上的丘腦、垂體、卵巢組織中，相對表達量基本上都在1左右。
　　同時，本研究鑒定了miR-505轉基因小鼠及近交系品系C57BL/6J的表型，包括:陰門開啟、角質化和生長曲線

7、，發(fā)現(xiàn)均無顯著性差異。
　　綜上所述，本研究成功的構建了檢測microRNA前體和成熟體的經濟實用、靈敏、高效的檢測方案;利用該技術對不同日齡、不同組織的轉基因小鼠和野生型小鼠進行分析，發(fā)現(xiàn)在轉基因小鼠中miR-505的前體是明顯提高的，但是成熟體在性發(fā)育相關丘腦-垂體-性腺軸上并沒有表現(xiàn)出來，表明轉基因小鼠的構建是成功的，但在基因表達水平上并沒有顯現(xiàn)出來;同時，由miR-505-3P和miR-505-5P在轉基因小鼠中表達量的差