四川松針散斑殼菌的種群結(jié)構(gòu)及其遺傳分析.pdf

1、松樹是北半球最重要的森林樹種，在中國的分布遍及全國，包括引進(jìn)栽培種在內(nèi)共有38種12變種，四川是全國松樹種類最多的省區(qū)，有7種2變種，主要有云南松、馬尾松、華山松、油松、高山松、濕地松、白皮松、思茅松等。四川林區(qū)是青藏高原東部林區(qū)的重要組成部分，其森林植被是維系長江流域生態(tài)平衡的主要天然屏障。松落針病也是世界常見病害之一，主要危害松樹苗木、幼林和成林，輕者引起松樹部分松針枯死、脫落，重者可引起70％以上松針枯死脫落，嚴(yán)重影響松樹的生長，

2、材積損失率可高達(dá)80％，甚至導(dǎo)致松樹整株枯死。松落針病也是我國松樹林區(qū)常見病害，分布廣，危害重，長期以來受到學(xué)者的高度重視。引起松落針病的病原菌是散斑殼屬真菌，該屬為斑痣盤菌科中最大一個屬，已報道有100多個種，可在多種針葉樹和闊葉樹上寄生。由于該屬真菌分布地域廣，寄主種類多，其系統(tǒng)發(fā)育及種的分類鑒定也備受人們關(guān)注，松樹生散斑殼菌的研究也是國內(nèi)外學(xué)者研究的重點(diǎn)。本文是歷經(jīng)多年對四川松樹落針病進(jìn)行調(diào)查分析，并著重對松落針病病原菌的種類及其

3、遺傳多樣性、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行全面系統(tǒng)的研究，以期完善我國松生散斑殼屬真菌的研究、為維護(hù)四川林區(qū)森林健康及松落針病的防控提供科學(xué)依據(jù)。 1．參照Minter提出的松生散斑殼菌形態(tài)分類依據(jù)，對采自四川近20個市縣的樣品進(jìn)行分類鑒定，共鑒定出散斑殼屬真菌7種，即針葉樹散斑殼（Lophodermium conigenum）、松針散斑殼（Lophodermi pinastri）、四川散斑殼（Lophodermium sichuanense

4、）、印度散斑殼（Lophodermium indianum）、南方散斑殼（Lophodermium australe）、二郎山散斑殼（Lophodermium erlangshanense）（待發(fā)表新種）、庫茂恩散斑殼（Lophodermium kumaunicum）。并根據(jù)主要形態(tài)分類特征提出了四川松生散斑殼菌種的分類檢索表。 2．以隨機(jī)采取400顆松針統(tǒng)計針葉上是否有子囊果的方法，對來自四川松樹林區(qū)29個采樣點(diǎn)的樣品進(jìn)行統(tǒng)計

5、分析表明，四川松樹林區(qū)均有不同程度的落針病發(fā)生，其發(fā)病率可高達(dá)50％以上；針葉樹散斑殼、松針散斑殼2個種在云南松、馬尾松、濕地松、高山松、華山松上均有出現(xiàn)，且常有混生現(xiàn)象，在云南松、濕地松和馬尾松上落地針葉上均有印度散斑殼菌存在，而南方散斑殼菌只在濕地松針葉上出現(xiàn)，庫曼散斑殼菌只在高山松上出現(xiàn)，但數(shù)量不多；四川散斑殼菌只在二郎山云南松活針葉上有發(fā)現(xiàn)，二郎山散斑殼菌只在二郎山和康定跑馬山的華山松活針葉和脫落針葉上有發(fā)現(xiàn)，數(shù)量較少。

6、 3．采用子囊果組織分離法對采自四川各地松針散斑殼菌材料進(jìn)行分離培養(yǎng)，共獲得菌株24個（編號L01至L-24），并對其培養(yǎng)菌落形態(tài)特征進(jìn)行了描述。通過降低養(yǎng)分濃度、改變碳源、更換不同種類的培養(yǎng)基等方法對生長于PDA平板上的散斑殼菌株進(jìn)行子囊孢子誘發(fā)實(shí)驗(yàn)，23℃條件下培養(yǎng)60d后均無有性態(tài)產(chǎn)生。 4．采用改良二次沉淀法和改良氯化芐法提取散斑殼菌培養(yǎng)物總DNA，用于RAPD分析和ITS測序，其結(jié)果證明改良后的二種DNA提取法均能滿足

7、分析測試要求，改進(jìn)方法是：在DNA提取之前，將各菌株培養(yǎng)物的菌絲體放入-20℃冰箱冷凍保存12小時以上，然后將冷凍后的菌絲體置于研缽中研磨，再加入相應(yīng)的提取液。 5．從160條RAPD引物中通過初篩、復(fù)選，共篩選出11個引物用于24個散斑殼菌株的RAPD分析，并對PCR反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，其最佳反應(yīng)條件是：25μlPCR反應(yīng)體積，10×Taq酶緩沖液（2．5μl），1．5UTaq酶，20ng DNA模板，0．4mmol/LdNT

8、Ps，4．0mmol/L Mg2+，0．48μmol/L引物，10．2μlddH2O。 6．利用11個引物對24個菌株進(jìn)行RAPD分析，共擴(kuò)增出217個位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)214個，占總數(shù)的98．6％，表明四川散斑殼菌遺傳多樣性非常豐富。對擴(kuò)增結(jié)果采用UPGMA法進(jìn)行聚類分析得到24個菌株的相似性系數(shù)聚類圖。聚類圖顯示，在相似性系數(shù)為0．28處，所有的供試菌株被分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ5類。其中，第Ⅰ類又可分為Ⅰ-1和Ⅰ-2兩個亞

9、類；Ⅰ-1類包含了形態(tài)學(xué)上具有較多共同特征的L．pinastri、L．conigenum兩個種。第Ⅳ類和第Ⅴ類因相似率很低而與其它類群分開，同樣也應(yīng)證了分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)的相關(guān)性。將寄主同為馬尾松的L．conigenum各菌株單獨(dú)進(jìn)行分析，聚類結(jié)果顯示同一種內(nèi)各菌株由于地域分隔而產(chǎn)生較大的遺傳分化；對來源于瀘定二郎山林場的L．pinastri和L．conigenum種內(nèi)各菌株構(gòu)建相似性系數(shù)矩陣，結(jié)果表明，寄主來源不同可能造成種內(nèi)不同程度

10、的遺傳分化。 7．利用真菌通用引物ITS1、ITS4成功對18個四川松上散斑殼菌株進(jìn)行了rDNA的ITS區(qū)堿基序列分析，其結(jié)果已被GenBank接受注冊（AY422489，AY422490，AY515318，AY515319， EU696766， EU696767， EU696768， EU696769， EU696770， EU696771， EU696772，EU696773， EU696774， EU696775， EU6

11、96776， EU696777， EU696778， EU679661）。采用DNAstar軟件對ITS區(qū)序列結(jié)果進(jìn)行多序列比較分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。與RAPD分析結(jié)果相似，18個菌株可以分成5大組（類）。與Genbank中已注冊的歐美國家的9株散斑殼菌ITS區(qū)序列結(jié)果進(jìn)行比對分析，其同源率最高為92．9％，四川散斑殼與歐美地區(qū)散斑殼菌的同源率較低，僅為70％至80％。 綜上所述，由于四川林區(qū)地理環(huán)境復(fù)雜、松樹種類多，其松落針病