載幽門螺桿菌Lpp20基因殼聚糖納米粒的制備及其黏膜免疫小鼠的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：構(gòu)建包裹幽門螺桿菌脂蛋白 Lpp20基因的殼聚糖納米粒，通過黏膜途徑免疫BALB/c小鼠，觀察其所產(chǎn)生的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平，為殼聚糖納米粒作為H. pylori DNA疫苗載體的應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：采用復(fù)凝聚法制備載幽門螺桿菌脂蛋白Lpp20基因的殼聚糖(CS)納米粒，用凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)分析殼聚糖和DNA的結(jié)合能力；用透射電鏡觀察粒子的形態(tài)和大??；用納米粒度儀測(cè)定粒徑分布和Zeta電位；用紫外分光光度法檢

2、測(cè)納米粒包封率；釋放實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)CS/DNA NPs的穩(wěn)定性；用DNaseI消化實(shí)驗(yàn)觀察CS/DNA NPs抗核酸酶降解的能力；用MTT法評(píng)價(jià)CS/DNA NPs細(xì)胞毒性。將裸質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/Lpp20和載基因殼聚糖納米粒通過黏膜免疫（滴鼻和口服）雌性BALB/c小鼠，測(cè)定免疫小鼠血清特異性IgG和腸黏膜sIgA水平，ELISA法檢測(cè)免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ、IL-4水平，MTT比色法檢測(cè)免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)

3、，免疫組化法檢測(cè)Lpp20蛋白在小鼠鼻黏膜組織中的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　(1)凝膠阻滯分析結(jié)果表明質(zhì)粒 DNA與殼聚糖之間通過靜電作用而完全結(jié)合，包封率大于90％。
　　(2)制備的載基因殼聚糖納米粒形態(tài)規(guī)則、大多成球形，粒徑分布150-300nm，Zeta電位約為13.4mV。
　　(3)殼聚糖對(duì)質(zhì)粒DNA有保護(hù)作用，能有效抵抗核酸酶降解。穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，4℃保存60d，殼聚糖納米粒仍能較穩(wěn)定地包裹Lpp

4、20。MTT法證明載基因殼聚糖納米粒在高濃度才出現(xiàn)低細(xì)胞毒性。
　　(4)裸質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/Lpp20與CS/DNA NPs通過黏膜免疫均能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)。CS/DNA NPs滴鼻和口服免疫組誘導(dǎo)的抗體明顯升高，與裸質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/Lpp20組相比有明顯差異(P<0.05)，同時(shí)CS/DNA NPs滴鼻和口服免疫組小鼠脾淋巴細(xì)胞經(jīng)特異性抗原刺激后，培養(yǎng)上清中IFN-γ和IL-4含量明顯升高，與裸

5、質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/Lpp20組、殼聚糖和PBS對(duì)照組之間差異具有顯著性(P<0.01)，且殼聚糖納米粒滴鼻免疫組高于口服組，差異也具有顯著性（P<0.05）；CS/DNA NPs滴鼻和口服免疫組小鼠脾淋巴細(xì)胞經(jīng)特異性抗原刺激后，刺激指數(shù)(分別為1.466±0.29和1.169±0.17)明顯高于裸質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/Lpp20組(0.788±0.11)、殼聚糖組（0.473±0.09）和PBS組(0.442±0.12)