殼聚糖CpG-ODN納米粒的制備及其免疫增強(qiáng)活性研究.pdf

1、隨著人類對基因的認(rèn)識和研究，功能基因不斷涌現(xiàn)。大量研究事實(shí)表明含CpG基序的DNA或人工合成的CpG-ODN是一種強(qiáng)有力的免疫刺激劑，可激活多種免疫細(xì)胞，誘導(dǎo)分泌以IL-12為主的Th1型細(xì)胞因子，誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答，在抗腫瘤、抗感染、抑止過敏反應(yīng)、作為免疫佐劑等方面得到廣泛應(yīng)用和研究。CpG核酸要發(fā)揮激活功能，必須作用于細(xì)胞內(nèi)的Toll樣受體-9(TLR-9)。然而，核酸不僅在體內(nèi)過程中容易被酶解，而且由于本身帶負(fù)電荷，不易結(jié)合到帶

2、負(fù)電的細(xì)胞表面，因此CpG核酸是否能被細(xì)胞有效攝取很大程度上影響其免疫激活功能，基因傳遞成為其發(fā)揮作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。殼聚糖（chitosan，CS）具有良好的生物相容性、生物可降解性以及無毒性，近幾年被用作基因載體材料已成為研究熱點(diǎn)。研究顯示，CS納米粒能有效傳遞基因，結(jié)合效應(yīng)細(xì)胞，提高基因的轉(zhuǎn)染及表達(dá)效率。然而迄今未見用CS作為材料制備納米粒運(yùn)載CpG-ODN用于正常小鼠體內(nèi)研究其免疫增強(qiáng)活性的報(bào)道，本論文將構(gòu)建CS-CpG-ODN基因

3、納米粒，初步探究其理化性質(zhì)及其它相關(guān)特性，繼而免疫接種于正常小鼠體內(nèi)研究免疫活性，期望獲得更強(qiáng)烈的免疫刺激效應(yīng)，以證實(shí)CS基因納米?？纱龠M(jìn)CpG-ODN發(fā)揮免疫刺激作用。本論文完成的研究工作主要包括以下三個方面：
　　 1.用復(fù)凝法制備CS-CpG-ODN基因納米粒，紫外分光光度法和水合茚三酮法分別測試CpG-ODN的包封率和載藥量，并通過單因素分析考察制備過程中幾種因素對納米粒包封率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CS-CpG-ODN基

4、因納米粒平均包封率為90.67%，平均載藥量為38.78%，均符合規(guī)定。在一定范圍內(nèi)，各因素對包封率影響較小。
　　 2.在透射電子顯微鏡下觀察納米粒形態(tài)，初步統(tǒng)計(jì)粒徑分布范圍，激光粒度分析儀測定納米粒粒徑、表面電位等。采用3%瓊脂糖凝膠電泳法進(jìn)行阻滯試驗(yàn)，驗(yàn)證納米粒復(fù)合物是否形成及其帶電電性，開展酶保護(hù)試驗(yàn)以考察納米粒抗酶特性。以L-02細(xì)胞和HepG2細(xì)胞作為模型細(xì)胞，研究CS納米粒的細(xì)胞轉(zhuǎn)染特性。結(jié)果顯示，納米粒得以形成，

5、在透射電鏡下觀察呈近似球形，大小較均一，粒徑主要分布在75-100nm之間，粒度分析儀測試粒徑均值為93.7nm，納米粒帶正電荷，表面電位均值為20.2mV。納米粒載體能有效抵抗高于生理?xiàng)l件下濃度核酶的裂解作用，保護(hù)CpG核酸不被酶解，轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該納米粒能被攝入至L-02細(xì)胞和HepG2細(xì)胞內(nèi)。
　　 3.小鼠隨機(jī)分成4組，包括對照組、CS組、CpG-ODN組和CS-CpG-ODN組，采用后大腿肌肉注射方式免疫接種小鼠，

6、兩周后同法加強(qiáng)免疫一次。末次免疫兩周后，處死小鼠，取脾臟供細(xì)胞免疫分析用，收集抗凝全血檢測T細(xì)胞亞群，收集細(xì)胞上清和血清以測定免疫球蛋白及細(xì)胞因子。MTT法進(jìn)行脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)，流式細(xì)胞術(shù)分析外周血T淋巴細(xì)胞亞群CD4+、CD8+各自百分比以及CD4+/CD8+比值，ELISA法測定細(xì)胞上清IFN-γ、IL-4分泌水平，檢測血清中IL-2、IL-12水平以及IgG水平。研究結(jié)果表明，小鼠經(jīng)免疫接種后，CS組和CpG-ODN組顯示出增強(qiáng)

7、的T淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng)，表明T細(xì)胞免疫應(yīng)答被激發(fā)；還表明外周血中CD4+T細(xì)胞百分比和CD4+/CD8+比值升高，細(xì)胞上清IFN-γ分泌增多，血清中IL-2、IL-12及IgG水平升高。于CS-CpG-ODN組，這些效應(yīng)和變化表現(xiàn)更為明顯，此外，IL-4分泌顯著減少。
　　 本論文采用復(fù)凝法成功構(gòu)建了CS-CpG-ODN基因納米粒，具有較小的粒徑，獲得了滿意的包封率和載藥量，具備較強(qiáng)保護(hù)CpG核酸效能，該帶正電的納米粒能夠被細(xì)胞攝