大鼠顱腦損傷后早期癲癇發(fā)作觀察及海馬改變.pdf

1、目的:制作大鼠顱腦液壓沖擊傷后早期癲癇發(fā)作模型,觀察不同打擊力度下其行為學(xué)改變及腦電圖異常;同時(shí)結(jié)合海馬的膠質(zhì)纖維酸性蛋白表達(dá)和海馬苔狀纖維變化,探討外傷后早期癲癇的發(fā)作機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.大鼠顱腦液壓沖擊傷致早期癲癇發(fā)作動(dòng)物模型制作
　　 SD大鼠50只,雌雄不限,體重300g-350g,隨機(jī)分為:①空白對照組10只,不給任何處理。②對照組(假手術(shù)組)10只,給予實(shí)驗(yàn)組大鼠相同的麻醉和手術(shù),但不給予

2、打擊。③手術(shù)組30只,按照不同打擊力度(0.1kPa、0.2kPa、0.3kPa.)分為3個(gè)亞組,每個(gè)亞組10只。
　　 10％水合氯醛腹腔麻醉后,縱行切開顱頂皮膚,在左側(cè)項(xiàng)骨(距矢狀縫,冠狀縫各5mm)處用牙科磨鉆去除直徑5mm的骨窗,保持硬膜的完整,將液壓打擊裝置的打擊管固定于骨窗,聚羧酸鋅水門汀固定密封連接處。用動(dòng)物立體定向儀將大鼠固定,待大鼠意識部分清醒后,調(diào)整致打擊力分別為0.1kPa、0.2kPa、0.3kPa,致大

3、鼠輕、中、重度腦損傷。縫合傷口,術(shù)后大鼠自由進(jìn)食水,不能進(jìn)食水者給予鼻飼進(jìn)食,致手術(shù)7天時(shí)處死。
　　 2.傷后行為學(xué)觀察及腦電監(jiān)測
　　 傷后進(jìn)行行為學(xué)觀察:觀察不同力度沖擊傷后大鼠癲癇發(fā)作的時(shí)間、程度,癲癇發(fā)作嚴(yán)重程度可根據(jù)改良過的Racine評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定:0級為無任何可探測到臨床征象的腦電圖型癲癇:Ⅰ級為口面部痙攣,點(diǎn)頭;II級為一側(cè)前肢陣發(fā)性抽搐;Ⅲ級為兩側(cè)前肢痙攣;4級為前肢陣攣和強(qiáng)直;Ⅴ級為前肢陣攣,強(qiáng)直

4、和松弛。癲癇平分0-Ⅱ級被認(rèn)為是局部型,評分工Ⅲ-Ⅴ級被認(rèn)為是繼發(fā)性全身性癲癇。整個(gè)監(jiān)測階段有2次或2次以上癲癇的動(dòng)物,被認(rèn)為有癲癇發(fā)作。
　　 同時(shí)進(jìn)行傷后腦電圖監(jiān)測3天,傷側(cè)腦部測量電極埋放固定:皮層淺層電極位置為前囟后1.0mm,中線旁2.0mm;海馬電極:前囟后3.8mm,中線旁2.0mm,深3.4mm。傷后腦電監(jiān)測3天。出現(xiàn)尖波、棘波、尖(棘)慢復(fù)合波時(shí)確定為有癲癇樣發(fā)作。
　　 3.大鼠海馬區(qū)域改變
　

5、　 3.1海馬區(qū)域病理改變
　　 隨機(jī)將每個(gè)亞組中的5只大鼠在傷后7d時(shí)候處死,經(jīng)左心室-升主動(dòng)脈插管,快速灌注生理鹽水150ml.、4％多聚甲醛300ml(4℃,0.1M的PBS配制,PH7.4)先快后慢灌注2h、用4％多聚甲醛固定24小時(shí)以上,取腦,以海馬為中心向兩側(cè)連續(xù)冠狀切片,片厚5μm,一套切片常規(guī)脫水,透明,浸蠟,做蘇木素一伊紅(HE)染色。對照組按同樣方法取腦,做HE染色。
　　 3.2海馬區(qū)域GFAP檢

6、測
　　 各組切片常規(guī)脫蠟、至水,用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶(SP)免疫組織化學(xué)染色試劑盒進(jìn)行GFAP染色,鏡下觀察,采集圖像。
　　 3.3海馬苔蘚纖維Timm染色
　　 將3個(gè)亞組模型制作后的15只大鼠于1周時(shí)麻醉后處死,迅速開胸,在左心室-胸主動(dòng)脈插管,快速灌注0.4％硫化鈉50ml,4℃的4％多聚甲醛300ml先快后慢灌注1h以上,0.4％硫化鈉150ml(7min),取腦,在4％多聚甲醛中固定30m

7、in-1h。隨后取出于30％蔗糖中過夜浸透沉底,取出,在恒冷切片機(jī)中連續(xù)冠狀切片,厚30μm。據(jù)Danscher改良的染色方法,在暗室下放入配制好的Timm染色液中,加入0.5ml的17％硝酸銀,水浴箱內(nèi)室溫孵育1-5小時(shí),自來水沖洗,脫水,透明,封固,鏡下觀察、采集圖像,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對照組同樣方法Timm染色。
　　 結(jié)果:
　　 1行為學(xué)表現(xiàn)
　　 癲癇發(fā)作頻率和強(qiáng)度隨打擊力度的增加而增加。輕度(0.1k

8、Pa)打擊傷組未見有癲癇行為,只有傷后弓背、抖須等表現(xiàn)。中度(0.2kPa.)沖擊傷后只有3只發(fā)生部分性發(fā)作。重度(0.3kPa)打擊傷大鼠早期癲癇全身性發(fā)作7只,表現(xiàn)為肢體或全身陣發(fā)性抽搐發(fā)作,嚴(yán)重者出現(xiàn)驚厥或全身性強(qiáng)直一陣攣發(fā)作;部分發(fā)作3只,行為學(xué)表現(xiàn)為刻板樣點(diǎn)頭、咀嚼、面部抽動(dòng)等行為發(fā)作。
　　 2腦電圖表現(xiàn)
　　 對照組大鼠腦電圖均表現(xiàn)為α波和β波為主要節(jié)律的基礎(chǔ)波。實(shí)驗(yàn)組3個(gè)亞組傷后均有短暫的抑制性低電壓,1

9、.5小時(shí)內(nèi)均消失。輕度打擊組未觀測到癲癇樣腦電波形;中度打擊傷組在傷后120±25min后可測到;癲癇樣腦電波在重度打擊傷后約90±45min后可測到,癲癇樣腦電圖波形表現(xiàn)為高幅的尖銳波峰和短暫突發(fā)的高大的尖波、棘波、尖(棘)慢復(fù)合波。
　　 3海馬的改變
　　 3.1海馬的病理改變
　　 傷后7天在光鏡下海馬組織切片HE染色顯示:對照組海馬CA3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量、形態(tài)和分布均正常。液壓沖擊組:傷后7天不同打擊組

10、海馬損傷中心區(qū)可見組織疏松,神經(jīng)細(xì)胞變形,深染,細(xì)胞周圍空泡變,核固縮可見,膠質(zhì)細(xì)胞增生肥大。重度打擊傷組明顯。
　　 3.2海馬區(qū)膠質(zhì)細(xì)胞GFAP測定
　　 空白對照組和假手術(shù)組大鼠海馬GFAP積分光密度測定,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無顯著性差別(P＞0.05),GFAP陽性細(xì)胞少,有零星表達(dá),胞體不明顯,樹突細(xì)少,染色淺。實(shí)驗(yàn)組3個(gè)亞組和對照組相比,均有顯著性差別(P＞0.05),星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP免疫組化染色增強(qiáng),胞體增大,細(xì)

11、胞突起變多增粗,分支增多。其中重度打擊傷組海馬與其他各組相比,均有顯著性差別(P＜0.05)。
　　 3.3海馬苔狀纖維Timm染色實(shí)驗(yàn)
　　 將大鼠海馬進(jìn)行Timm染色后,在光鏡下進(jìn)行觀察苔狀纖維出芽。對照組大鼠海馬的齒狀回和CA3區(qū)各層清晰,而早期癲癇發(fā)作組(重度打擊傷組)大鼠的海馬齒狀回各層著色不均勻,著色均深,呈現(xiàn)出在齒狀回分子層內(nèi)帶和顆粒細(xì)胞上層連續(xù)、濃染的帶狀Timm's染色顆粒。
　　 結(jié)論: