rhBMP-7注射劑的制備及其對大鼠腎衰模型作用的觀察.pdf

1、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7（Bone morphogenetic protein-7，BMP-7）又名成骨蛋白-1（Osteogenic Protein，OP-1），屬于轉(zhuǎn)化生長因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β）超家族，調(diào)節(jié)多種細胞的生長、分化及調(diào)亡。研究發(fā)現(xiàn)BMP-7不僅具有骨誘導(dǎo)作用，而且在促進腎臟發(fā)育、維持腎臟正常生理功能等方面發(fā)揮著重要的作用。 目前市場上已經(jīng)有rhBMP-7埋植劑和

2、rhBMP-7泥灰兩種劑型，分別用于治療骨缺損和脊柱修補。但是rhBMP-7的溶解度小，易生成沉淀，阻礙了rhBMP-7注射劑型的開發(fā)和臨床應(yīng)用。 目前臨床使用的rhBMP-7均為真核細胞表達。真核表達的rhBMP-7表達量低，成本高，價格昂貴，限制了其在臨床上的應(yīng)用。用而采用原核系統(tǒng)表達rhBMP-7具有操作簡單、基因穩(wěn)定、表達量高的優(yōu)點，缺點是不能進行翻譯后修飾，需要經(jīng)過復(fù)性工藝處理。本實驗室前期對原核系統(tǒng)表達rhBMP-7

3、已經(jīng)進行了充分的研究，發(fā)現(xiàn)其經(jīng)過純化復(fù)性后具有良好的骨誘導(dǎo)活性。目前，臨床上尚沒有治療腎衰的特效藥物，而已有的研究證實BMP-7在多種腎病動物模型能夠抑制纖維化，保護腎功能，甚至逆轉(zhuǎn)業(yè)已形成的腎纖維化。探索增加原核表達的rhBMP-7溶解度的方法，獲得可溶性rhBMP-7進而制備注射劑型，可以為研究BMP-7對腎功能衰竭等疾病的作用提供物質(zhì)基礎(chǔ)，對降低成本、拓展rhBMP-7的臨床應(yīng)用范圍有重要意義。 研究目的: 1.利

4、用重組大腸桿菌獲得高表達量、高純度的rhBMP-7，然后探索增加rhBMP-7溶解度的方法，獲得rhBMP-7，并經(jīng)去除內(nèi)毒素、除菌、冷凍干燥等操作，制備rhBMP-7的注射型制劑及凍干粉末，并對制劑的澄清度、穩(wěn)定性、活性、急性毒性進行檢測。 2.建造腎功能衰竭模型，初步探究rhBMP-7注射型制劑對腎衰動物的藥理作用。 3.針對包涵體復(fù)性工藝方面存在的復(fù)性率低的問題，通過先純化后復(fù)性的方法，試圖獲得更多的rhBMP-7

5、活性二聚體。 研究方法: 1.經(jīng)重組大腸桿菌的發(fā)酵大量表達rhBMP-7，菌體經(jīng)裂解、洗滌后用8mol/L尿素溶解包涵體，然后采用SP-FF陽離子交換層析法對目的蛋白進行純化，絕大部分雜蛋白被去除，獲得高純度的目的蛋白，利用逐步降低尿素濃度的方法對純化的蛋白進行復(fù)性從而獲得rhBMP-7二聚體，然后通過加入助溶劑L-精氨酸的方法增加rhBMP-7溶解度。采用DEAE-瓊脂糖層析的方法去除內(nèi)毒素，然后經(jīng)濾膜除菌后制備注射劑

6、型，并采用冷凍干燥的方法制備凍干粉末。采用凝膠電泳法檢測制劑的穩(wěn)定性，采用鱟試劑檢測內(nèi)毒素含量，觀察制劑對細胞增值的影響，并觀察制劑對嚙齒類的急性毒性 2.建立腺嘌呤誘導(dǎo)的大鼠慢性腎衰制模型，將實驗動物分為正常組、模型組、模型對照組、rhBMP-7預(yù)防組、rhBMP-7治療組，檢測各組大鼠的血液及生化指標(biāo)，觀察rhBMP-7對慢性腎衰大鼠血液及生化指標(biāo)的影響，并觀察其對腎臟病理組織學(xué)改變的影響。 3.表達rhBMP-7的

7、工程菌經(jīng)發(fā)酵、裂菌、提取包涵體后，4℃下依次在尿素濃度為4 mol/L、2 mol/L、1 mol/L的磷酸鹽緩沖液中透析使蛋白復(fù)性，經(jīng)凝膠電泳觀察rhBMP-7二聚體的生成情況，然后再通過層析色譜法純化，經(jīng)凝膠電泳法檢測rhBMP-7二聚體純度。 研究結(jié)果: 1.制備的rhBMP-7注射劑溶液澄清度，凍干粉末復(fù)溶后無沉淀產(chǎn)生；熱原含量在限量以下；能促進細胞的生長，對大鼠和小鼠無急性毒性作用，低溫下可較長時間保存。

8、 2.rhBMP-7在不同程度上降低慢性腎衰大鼠的BUN、Cr、UA、磷含量，增加鈣含量，改善貧血，降低腎臟指數(shù)，減輕腎衰大鼠的腎臟損傷。 3.純化后復(fù)性的方法獲得的rhBMP-7以單體和二聚體形式存在，純度達95％以上，其中rhBMP-7二聚體含量可達60％以上。 結(jié)論: 制備的rhBMP-7注射劑溶液澄清，無熱原，穩(wěn)定性較好，有較好的生物學(xué)活性，對大鼠和小鼠無急性毒性作用，有一定的應(yīng)用價值。該制劑對腺嘌呤致