NFAT調(diào)控皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的Leydig細胞凋亡中FasL表達機制的研究.pdf

1、死亡受體屬于腫瘤壞死因子受體基因超家族成員，可傳導(dǎo)由特定的死亡配體引起的凋亡信號。激活這些受體的配體屬于腫瘤壞死因子超基因家族。FasL是Fas在體內(nèi)的天然配體，膜結(jié)合型和可溶性的FasL均可與Fas交聯(lián)，并誘導(dǎo)Fas三聚體的形成，繼而導(dǎo)致Fas分子膜質(zhì)區(qū)的死亡域與另一種具有死亡結(jié)構(gòu)域的Fas相關(guān)蛋白結(jié)合，促使FADD N端的死亡域與胱天蛋白酶8酶原相互作用并激活Caspase-8，最終導(dǎo)致表達Fas的細胞呈生理性死亡。 Fa

2、sL基因編碼的產(chǎn)物是一種介導(dǎo)細胞凋亡的重要跨膜蛋白，其表達調(diào)控涉及多種轉(zhuǎn)錄因子的參與。胞外刺激因素可通過調(diào)節(jié)多種與FasL相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的表達或活性來影響FasL的表達水平，并最終導(dǎo)致靶細胞的凋亡。在T細胞中，F(xiàn)asL的表達主要是受NFAT調(diào)控，其過程涉及到在Ca<’2+>或及鈣調(diào)蛋白的參與下，經(jīng)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶激活的一系列步驟。免疫抑制劑環(huán)胞菌素A可抑制CaN的活性，使NFMT的去磷酸化反應(yīng)及向核內(nèi)轉(zhuǎn)移的過程受阻，最終影響其對FasL表

3、達的調(diào)控。 本研究分為四個部分： 第一部分：Ca<'2+>／CaN依賴的信號通路參與皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的MLTC凋亡中FasL的表達 先前的研究結(jié)果使得在以MLTC作為細胞模型的本研究中，為闡明在皮質(zhì)酮處理的Leydig細胞中有關(guān)NFAT調(diào)控FasL表達的機制，需先證實在皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的MLTC凋亡中同樣有Ca抖濃度升高、增加的CaN活性和FasL表達量及存在NFAT表達的事實。 用流式細胞儀檢測經(jīng)Annexin V

4、-FITC／PI雙標的Leydig細胞，結(jié)果顯示：經(jīng)100nM皮質(zhì)酮處理的MLTC的凋亡率較未處理組有顯著增加。經(jīng)CsA和皮質(zhì)酮共同處理的細胞，其凋亡率則顯著減少。將經(jīng)100nM皮質(zhì)酮處理的MLTC基因組DNA提取后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析發(fā)現(xiàn)，存在凋亡特有的DNA ladder條帶。利用鈣定性探針Fluo-3／AM檢測發(fā)現(xiàn)，經(jīng)100nM皮質(zhì)酮處理的MLTc，其Ca<'2+>濃度顯著增加。采用酶底物法測定細胞中CaN活性發(fā)現(xiàn)，經(jīng)100nM

5、皮質(zhì)酮處理的MLTC，其CaN活性顯著升高，但這一升高的活性可被CaN的抑制劑CsA抑制。用RT-PER和Wes ternblot檢測經(jīng)100rN皮質(zhì)酮處理的MLTC中FasL的表達，結(jié)果表明：處理組FasL mRNA和蛋白表達水平與未處理組相比均呈顯著增加。經(jīng)皮質(zhì)酮和CsA共同處理的細胞，其FasL mRNA和蛋白表達水平則與對照組無顯著差異。用RT-PCR和Western blot方法檢測發(fā)現(xiàn)：在MLTC中有NFAT2的表達，證實該

6、細胞表達NFAT2。 本部分的實驗結(jié)果提示：在MLTC中可能同樣存在Ca<'2+>／CaN依賴的信號通路，因細胞經(jīng)高濃度皮質(zhì)酮處理后，ca<'2+>和CaN的變化與細胞中FasL的表達呈正相關(guān)。尤其是證實了轉(zhuǎn)錄因子NFAT2在MLTC中也有表達。 第二部分：FasL啟動子報告載體的構(gòu)建及其活性分析 本部分的研究是通過構(gòu)建含有FasL啟動子的熒光素酶報告載體來觀察在皮質(zhì)酮處理的Leydig細胞中，調(diào)控FasL的表

7、達是否發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。并由此確定FasL啟動子的核心序列，此可為進一步研究調(diào)控區(qū)中順式作用元件的位置及與之相互作用的反式作用因子的種類和功能，并為最終闡明調(diào)控FasL表達的機制提供可能。 首先提取小鼠基因組DNA，利用PCR方法擴增了長度為689bp的FasL基因5’非編碼區(qū)片段，在此基礎(chǔ)上再分別擴增長度為329bp、272bp、238bp、209bp及138bp的5’非編碼區(qū)片段。將上述片段分別與pGL3-Basic載體連接，

8、構(gòu)建成含有FasL啟動子的熒光素酶報告載體。利用脂質(zhì)體將含有不同長度的FasL啟動子報告載體瞬時轉(zhuǎn)染入經(jīng)100nM皮質(zhì)酮處理的Leydig細胞，經(jīng)熒光素酶活性檢測發(fā)現(xiàn)：不同的報告載體均能顯示出不同程度的表達活性。 本部分的實驗結(jié)果表明：含有FasL啟動子的熒光素酶報告載體已被成功構(gòu)建。在經(jīng)高濃度皮質(zhì)酮處理的Leydig細胞中，F(xiàn)asL啟動子的核心調(diào)控元件位于-201-+71范圍內(nèi)。 第三部分：NFAT活性的初步研究

9、 在免疫系統(tǒng)中，NFAT對FasL表達的調(diào)控作用取決于前者能否被活化?；罨腘FAT從胞漿移至核內(nèi)，與FasL啟動子結(jié)合、相互作用。因此，評價NFAT在皮質(zhì)酮處理前后的Leydig細胞中的定位情況是分析其功能的前題。在本部分的工作中，我們用EGFP標記法觀察皮質(zhì)酮處理前后的Ieyidg細胞中NFAT2的位置改變情況。此外，我們還構(gòu)建了表達NFAT2的細胞株，此可為進一步研究NFAT調(diào)控FasL的表達機制提供幫助。 利用RT-P

10、CR方法從淋巴細胞中擴增NFAT2的編碼序列，經(jīng)測序鑒定證實該序列與文獻報道一致后，將其與真核表達載體pEGFP-C1連接，構(gòu)建pEGFP-NFAT2融合的表達載體。挑取陽性克隆后進一步測序，經(jīng)分析證實未出現(xiàn)移碼后，將其瞬時轉(zhuǎn)染Leydig細胞，提取細胞內(nèi)總RNA后，采用RT-PER分析表明：該表達載體可用于介導(dǎo)NFAT2在Leydig細胞中進行有效表達。將pEGFP-NFAT2表達載體轉(zhuǎn)染Leydig細胞，于36h時經(jīng)100nM皮質(zhì)酮

11、處理，48h時用激光掃描共聚焦顯微鏡觀測NFAT2在細胞內(nèi)定位發(fā)現(xiàn)，Leydig細胞經(jīng)皮質(zhì)酮處理后，細胞內(nèi)的NFAT2從胞漿移向胞核。此外，我們將所構(gòu)建的pcDNA3-l-NFAT2表達載體轉(zhuǎn)染Leydig細胞后，經(jīng)G418加壓篩選，用RT-PCR和Western blot方法篩選陽性克隆，獲得了能穩(wěn)定表達NFAT2的細胞株。 研究結(jié)果表明：經(jīng)100nM皮質(zhì)酮處理后的Leyidg細胞，其中的NFAT2在細胞內(nèi)的定位有一個動態(tài)變

12、化過程。而經(jīng)皮質(zhì)酮和CaN抑制劑CsA共同處理的Leydig細胞，其NFAT2仍停留于胞漿中，未出現(xiàn)向核內(nèi)移動的現(xiàn)象，故不會引起FasL表達的上調(diào)?？梢?，NFAT2在細胞內(nèi)的移位對其功能發(fā)揮起著重要作用。 第四部分：NFAT調(diào)控FasL的表達及其機制的研究 在上述三部分的工作中，我們證實了經(jīng)皮質(zhì)酮處理的Leydig細胞中有Ca<'2+>／CaN依賴的信號通路的參與(即：有增加的Ca<'2+>水平和CaN活性，NFAT2的

13、表達和增加的FasL表達量)。確定了經(jīng)皮質(zhì)酮處理的Leydig細胞中FasL啟動子的核心調(diào)控元件。完成了對NFAT2活性的初步分析。在此基礎(chǔ)上，將進一步研究NFAT2是否確實參與對FasL表達的調(diào)控及其可能的作用機制。 本部分的內(nèi)容，一是證實了轉(zhuǎn)錄因子NFAT2在小鼠腫瘤Leydig細胞中有表達的基礎(chǔ)上，我們首先利用穩(wěn)定表達NFAT2的細胞株作為細胞模型，觀察經(jīng)皮質(zhì)酮處理的Leydig細胞中FasL mRNA及蛋白質(zhì)的表達水平，

14、同時測定上述情況下細胞的凋亡率。結(jié)果顯示：經(jīng)皮質(zhì)酮處理后細胞株中FasL的mRNA和蛋白水平均顯著上升。皮質(zhì)酮和CsA共同處理組中的FasL mRNA和蛋白水平與未處理組相比則無顯著變化。Leydig細胞經(jīng)100nM皮質(zhì)酮處理12h，其凋亡率顯著增加，若將皮質(zhì)酮和CsA共同處理Leydig細胞，則凋亡率顯著減少，表明：NFET2參與了皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的Leydig細胞凋亡的過程。此外，采用RNA干擾技術(shù)評價在NFAT2的表達受到干擾的情況下，

15、檢測FasL mRNA及蛋白質(zhì)的表達量發(fā)現(xiàn)： NFAT2表達受到抑制后，經(jīng)100nM皮質(zhì)酮處理Leydig細胞中FasL的表達未呈現(xiàn)顯著上調(diào)。進一步證實NFAT2參與了皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的Leydig細胞凋亡的過程。 在證實了NFAT2對FasL表達具有調(diào)控作用的基礎(chǔ)上，本部分的第二項內(nèi)容是進一步評價有關(guān)NFAT2調(diào)控FasL表達的機制。我們采用共轉(zhuǎn)染和突變分析實驗來研究在皮質(zhì)酮處理的Leydig細胞中，NFAT2是否通過調(diào)控FasL

16、啟動子活性來控制FasL的表達。利用脂質(zhì)體將FasL啟動子熒光素酶報告載體pGL3一FLP272一luc和NFAT表達載體pcDNA3.1-NFAT2瞬時共轉(zhuǎn)染Leydig細胞，經(jīng)熒光素酶檢測發(fā)現(xiàn)：經(jīng)100nM皮質(zhì)酮處理12h的Leydig細胞，其熒光素酶活性與未處理組相比呈顯著增高，表明：NFAT2對FasL啟動子具有明顯的調(diào)控作用。此外，我們設(shè)計了FasL啟動子上NFAT結(jié)合位點的突變引物，用PCR方法，擴增該突變片段，即：272b

17、p的FasL5’非編碼區(qū)片段，經(jīng)測序鑒定后，將其與pGL3一Basic載體連接，構(gòu)建FasL啟動子上NFAT結(jié)合位點突變的熒光素酶報告載體。利用脂質(zhì)體將pGL3一FLP272mut—luc和NFAT表達載體pcDNA3.1-NFAT2瞬時共轉(zhuǎn)染Leydig細胞，經(jīng)熒光素酶檢測發(fā)現(xiàn)：經(jīng)皮質(zhì)酮處理12h的Leydig細胞，其熒光素酶活性與未處理組相比無顯著差別。上述結(jié)果進一步表明，NFAT2對FasL啟動子具有顯著的調(diào)控作用。本文最后一部分