低劑量的ECPs誘導(dǎo)機(jī)體適應(yīng)性反應(yīng)差異表達(dá)基因的研究.pdf

1、機(jī)體及其細(xì)胞經(jīng)常受到各種環(huán)境因子的作用。環(huán)境中存在著物理、化學(xué)和生物等不同因子，它們引起機(jī)體和細(xì)胞的反應(yīng)特點(diǎn)，一方面受制于機(jī)體固有遺傳結(jié)構(gòu)的進(jìn)化發(fā)育階段和功能狀態(tài)，另一方面取決于環(huán)境因子的性質(zhì)和劑量。隨著工業(yè)的發(fā)展，環(huán)境化學(xué)因子日益增多，其對(duì)健康的影響受到關(guān)注。近年來，高濃度接觸所致急性中毒和損傷在人們的努力下已大為減少，而代之低濃度，甚至是極低濃度的接觸，這些接觸和高濃度接觸在健康效應(yīng)上有著什么樣的區(qū)別；在進(jìn)行危險(xiǎn)度評(píng)定和管理中應(yīng)采取

2、什么樣的策略；在保護(hù)環(huán)境和人體健康的前提下，如何更好地促進(jìn)化學(xué)工業(yè)的發(fā)展；是人們更為關(guān)心的問題。所以，低水平的環(huán)境化學(xué)因子誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)和機(jī)制及其對(duì)人類健康評(píng)定的影響成為目前毒理學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。本研究建立了ECPs包括過氧化氫(H2O2)、甲醛(FA)、三氯乙烯(TCE)、氫醌(HQ)誘導(dǎo)細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)的模型，并用熒光差異顯示PCR技術(shù)尋找不同處理差異表達(dá)的基因，通過進(jìn)一步的鑒定和驗(yàn)證，為探討低劑量的ECPs誘導(dǎo)細(xì)胞適應(yīng)性反

3、應(yīng)的機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。 方法：1ECPs誘導(dǎo)細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)模型的建立 用一系列劑量的H2O2對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞(MRC-5)進(jìn)行染毒，MTT法獲得H2O2對(duì)細(xì)胞毒性的劑量效應(yīng)關(guān)系和時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。選擇對(duì)細(xì)胞沒有損傷或者有增殖效應(yīng)的劑量為低劑量，對(duì)細(xì)胞有明顯損傷效應(yīng)的劑量為高劑量，然后用低劑量的毒物預(yù)刺激細(xì)胞一定的時(shí)間后，繼而用大劑量的同一毒物攻擊，觀察細(xì)胞的損傷效應(yīng)，將低劑量預(yù)刺激后可以減輕繼而大劑量攻擊的損傷效應(yīng)的一組劑

4、量作為適應(yīng)型反應(yīng)模型的劑量。用乳酸脫氫酶漏出率(LDH％)、Annexinv/PI檢測(cè)細(xì)胞凋亡來驗(yàn)證H2O2誘導(dǎo)MRC-5適應(yīng)性反應(yīng)的模型。FA、TCE、HQ的劑量效應(yīng)關(guān)系及其適應(yīng)性反應(yīng)模型的建立由課題組的其他科研人員進(jìn)行。 2熒光差異顯示PCR尋找不同處理組差異表達(dá)的基因 H2O2、FA、TCE、HQ分別對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染毒，按：對(duì)照組、低劑量組、高劑量組，適應(yīng)性反應(yīng)組處理細(xì)胞，在各組細(xì)胞染毒終止后，提取細(xì)胞總RNA，用無R

5、NA酶的DNA酶清除污染的DNA，紫外分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳分別檢測(cè)其純度和完整性。優(yōu)化熒光差異顯示PCR的錨定引物(APs)和隨機(jī)引物(ARPs)，然后用APs進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(RT)反應(yīng)，合成cDNA，再用優(yōu)化的APs和ARPs組合，進(jìn)行熒光差異顯示PCR，最后進(jìn)行5.6％聚丙烯酰胺凝膠電泳。通過GenomyxSC掃描系統(tǒng)掃描，用系統(tǒng)所帶的AcquireSC軟件進(jìn)行定位，分離差異表達(dá)的基因。 3差異條帶的再擴(kuò)增、克隆、鑒定、測(cè)

6、序及同源性比較 選擇感興趣的差異條帶進(jìn)行再擴(kuò)增，電泳鑒定后，克隆到pGEM-T載體，對(duì)陽性重組菌通過菌落PCR鑒定，測(cè)序。然后將獲得的序列和NCBI上提供的包括GeneBank+EMBL+DDBJ+PBD的核酸序列數(shù)據(jù)庫BLAST，進(jìn)行同源性分析。4用熒光定量PCR方法驗(yàn)證目的基因是否差異表達(dá) 將H2O2處理的各組細(xì)胞的總RNA進(jìn)行常規(guī)RT，然后以cDNA為模板，根據(jù)條帶的測(cè)序結(jié)果按熒光定量PCR要求設(shè)計(jì)引物，采用SYB

7、RGreenⅠ熒光染料相對(duì)定量的方法檢測(cè)基因的表達(dá)。以β-actin為內(nèi)參，通過目的基因和內(nèi)參的標(biāo)準(zhǔn)曲線來保證兩者的擴(kuò)增效率相同，以便相對(duì)定量。熔解曲線消除引物二聚體對(duì)結(jié)果的影響。然后進(jìn)行相對(duì)定量驗(yàn)證所得目的基因是否差異表達(dá)。 結(jié)果1ECPs誘導(dǎo)細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)模型的建立 用0、0.088、0.88、8.8、88、880、1100、2200、4400、8800μmol/L的H2O2對(duì)MRC-5細(xì)胞染毒6h，通過MTT法獲得

8、對(duì)MRC-5毒性的劑量效應(yīng)關(guān)系，發(fā)現(xiàn)0.088-88μmol/L范圍內(nèi)的H2O2對(duì)細(xì)胞幾乎沒有損傷(P＞0.05)；從880μmol/L開始，H2O2對(duì)細(xì)胞有明顯損傷(P＜0.05)。然后進(jìn)行H2O2對(duì)MRC-5時(shí)間效應(yīng)關(guān)系的分析，發(fā)現(xiàn)H2O2對(duì)細(xì)胞染毒1～24h，其毒性沒有顯著的變化(P＞0.05)。所以將0.088、0.88、8.8、88μmol/L作為低劑量，預(yù)刺激細(xì)胞24h后，然后把1100μmol/L作為高劑量刺激細(xì)胞1h。觀

9、察發(fā)現(xiàn)用0.088、0.88、8.8μmol/L的H2O2預(yù)刺激細(xì)胞后，繼而用1100μmol/L的H2O2攻擊，細(xì)胞的損傷明顯較直接用1100μmol/L刺激的損傷輕，而且0.88μmol/L預(yù)刺激后這種效果更為明顯，故將0.88μmol/L預(yù)刺激細(xì)胞24h，1100μmol/L攻擊1h作為H2O2誘導(dǎo)MRC-5適應(yīng)性反應(yīng)的模型。 乳酸脫氫酶漏出率(LDH％)的檢測(cè)：將細(xì)胞按對(duì)照組、低劑量組、高劑量組、適應(yīng)性反應(yīng)組處理后，檢測(cè)

10、LDH漏出率，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組和低劑量組LDH的漏出率差別很小，統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有顯著差異(P＞0.05)；而高劑量組LDH的漏出率和對(duì)照組比較，顯著增高(P＜0.05)；適應(yīng)性反應(yīng)組LDH的漏出率比高劑量組明顯下降，但是還未能夠恢復(fù)到對(duì)照組的水平。 Annexinv/PI檢測(cè)細(xì)胞凋亡：同上述處理細(xì)胞后檢測(cè)凋亡，發(fā)現(xiàn)：低劑量與對(duì)照組比較，活細(xì)胞數(shù)相對(duì)少一些(P＞0.05)，死細(xì)胞數(shù)和凋亡細(xì)胞數(shù)相對(duì)多一些(P＞0.05)；而高劑量組和對(duì)照組比

11、較，活細(xì)胞數(shù)明顯減少(P＜0.05)，死細(xì)胞數(shù)增多(P＜0.05)，而凋亡細(xì)胞數(shù)變化不大(P＞0.05)；適應(yīng)性反應(yīng)組的活細(xì)胞數(shù)與高劑量組比較有所增多，死細(xì)胞數(shù)減少，凋亡細(xì)胞數(shù)略有增多。 乳酸脫氫酶漏出率(LDH％)的檢測(cè)和Annexinv/PI檢測(cè)細(xì)胞凋亡的結(jié)果都驗(yàn)證了通過MTT法所獲得的適應(yīng)性反應(yīng)的模型。 FA、TCE、HQ的劑量效應(yīng)關(guān)系及適應(yīng)性反應(yīng)模型的劑量參照課題組的試驗(yàn)結(jié)果。 2熒光差異顯示PCR尋找差

12、異表達(dá)的條帶 以H2O2、FA、TCE、HQ不同處理組的細(xì)胞總RNA用特定APs逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，選擇優(yōu)化的APs和ARPs組合，進(jìn)行熒光差異顯示PCR，然后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，通過熒光掃描、定位獲得差異條帶。將低劑量組、高劑量組、適應(yīng)性反應(yīng)組與對(duì)照組比較：H2O2有60個(gè)差異條帶、FA有61個(gè)，TCE有52個(gè)，HQ有33個(gè)。 3差異條帶的再擴(kuò)增、克隆、鑒定、測(cè)序及同源性比較 選擇差異比較明顯的條帶進(jìn)行

13、二次PCR，然后通過進(jìn)一步克隆、測(cè)序、同源性比較發(fā)現(xiàn)： H2O2的15個(gè)再擴(kuò)增的條帶中，有8個(gè)新基因，7個(gè)已知基因； FA的11個(gè)再擴(kuò)增的條帶中，有9個(gè)新基因，2個(gè)已知基因； HQ的8個(gè)再擴(kuò)增的條帶中，有7個(gè)新基因，1個(gè)已知基因。 4用熒光定量PCR進(jìn)行差異條帶的驗(yàn)證 將H2O2部分差異條帶(H8，H18，H21，H30，H34)采用SYBRgreenⅠ熒光染料進(jìn)行相對(duì)定量，目的基因和內(nèi)參的標(biāo)準(zhǔn)曲

14、線表明擴(kuò)增效率均在90～110％，熔解曲線均為單峰曲線，消除了引物二聚體對(duì)結(jié)果的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明各個(gè)片斷表達(dá)的差異均和熒光差異顯示PCR結(jié)果一致。 結(jié)論1本研究采用了傳統(tǒng)差異顯示PCR的改良技術(shù)——熒光標(biāo)記差異顯示PCR法，在引物設(shè)計(jì)、PCR條件、凝膠濃度、電泳條件以及標(biāo)記物等方面有所改進(jìn)，極大地減少了傳統(tǒng)該方法的不足，也大大降低了該方法的假陽性率。 2成功建立了H2O2誘導(dǎo)MRC-5的適應(yīng)性反應(yīng)的模型，并通過熒光差異

15、顯示PCR，找到ECPs誘導(dǎo)機(jī)體適應(yīng)性反應(yīng)過程中差異表達(dá)的基因，將這些基因進(jìn)行克隆，測(cè)序，同源性比較，最后通過熒光定量PCR驗(yàn)證基因表達(dá)的差異。 3四種毒物誘導(dǎo)機(jī)體適應(yīng)性反應(yīng)差異表達(dá)基因結(jié)果表明低劑量的ECPs誘導(dǎo)適應(yīng)性反應(yīng)的機(jī)制有以下幾個(gè)方面：1)維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的蛋白的參與：如核糖體蛋白S15a、核糖體蛋白S10、LAMP2、MRPL47、凋亡相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1(BCLAF1)；2)抗氧化系統(tǒng)的參與：如SOD1；3)DNA損傷修復(fù)系