骨髓細(xì)胞動(dòng)員對(duì)靜脈血栓溶解、再通的作用及機(jī)理.pdf

1、研究背景： 靜脈血栓主要包括深靜脈血栓形成和肺栓塞，歐美國(guó)家每年靜脈血栓的發(fā)病率為每10萬(wàn)普通人群中有100-200人。我國(guó)目前缺乏準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。靜脈血栓是血管外科常見疾病，隨著人們生活水平的提高，近年來(lái)發(fā)病率顯著上升。靜脈血栓常引起血栓后綜合癥(postthrombotic syndrome)，使治療費(fèi)用高，療效差。目前國(guó)內(nèi)外靜脈血栓的治療主要是抗凝和溶栓非手術(shù)措施。抗凝治療不能去除已經(jīng)形成的血栓，溶栓治療只對(duì)血栓的表面部分

2、有效，其溶栓作用相當(dāng)有限，溶栓治療并不能減輕血栓后綜合癥的嚴(yán)重程度，溶栓和抗凝治療有導(dǎo)致嚴(yán)重出血的風(fēng)險(xiǎn)。 本研究擬探討骨髓細(xì)胞動(dòng)員對(duì)靜脈血栓溶解和再通的作用及可能機(jī)理。 研究方法： 1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn) Sprague-Dawley雄性大鼠隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、血栓組和骨髓動(dòng)員組。正常組未行任何處理。假手術(shù)組大鼠的下腔靜脈未行縮窄及阻斷，余處理同血栓組。骨髓動(dòng)員組為模型鼠術(shù)后當(dāng)d開始連續(xù)7d在腹部皮下按25u

3、g/kg注射rhG-CSF或rhGM-CSF，其余組注射等體積生理鹽水。大鼠靜脈血栓模型的建立參照Modarai方法加以改進(jìn)。顯露左腎靜脈以下下腔靜脈至左右髂總靜脈匯合處，離斷并結(jié)扎該段下腔靜脈屬支，神經(jīng)血管鉗阻斷下腔靜脈1min，松開30s，再阻斷1min，順下腔靜脈放置頭皮針頭，以4-0絲線于左腎靜脈下方結(jié)扎下腔靜脈和頭皮針頭，取出頭皮針頭，縫合腹壁。術(shù)后動(dòng)物自由飲水，正常飼養(yǎng)。 術(shù)后7d取血栓組和骨髓動(dòng)員組下腔靜脈標(biāo)本，術(shù)

4、后14d取假手術(shù)組、血栓組和骨髓動(dòng)員組下腔靜脈標(biāo)本。切取左腎靜脈以下下腔靜脈至左右髂總靜脈匯合處，用于組織形態(tài)學(xué)和免疫組化觀察。 術(shù)前0.5h，術(shù)后1、3、5、7和10d采集外周血，以全自動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)分析儀檢測(cè)白細(xì)胞總數(shù)，血涂片顯微鏡下計(jì)數(shù)MNC比例。 將4％多聚甲醛溶液中固定過(guò)夜的組織石蠟包埋，制成5μm厚的石蠟切片，于縮窄線以下開始切片，連續(xù)觀察間隔50μm的血栓病理組織切片3張，于顯微鏡下選定、攝取血栓的圖像，圖像

5、分析系統(tǒng)測(cè)定每張切片中血栓機(jī)化部分的面積和血栓總面積，計(jì)算二者比值的百分?jǐn)?shù)，算出3張切片的平均百分?jǐn)?shù)，即為該標(biāo)本的血栓機(jī)化率。用CD68單抗定位血栓中巨噬細(xì)胞，圖像分析系統(tǒng)算出血栓的巨噬細(xì)胞密度。電鏡觀察血栓的超微結(jié)構(gòu)。 外周血中MCP-1和MIP-1α水平用ELISA法檢測(cè)，操作分別按大鼠MCP-1 ELISA Kit(BioSource)和大鼠MIP-1αELISA Kit(Antigenix)說(shuō)明書進(jìn)行。外周血總RNA提取

6、按Catrimox-14<'TM>RNA Isolation Kit Ver.2.11(TaKaRa公司)的說(shuō)明步驟進(jìn)行。RT-PCR擴(kuò)增參照TaKaRaRNA PCR Kit(AMY)Ver.3.0試劑盒操作說(shuō)明書進(jìn)行。PCR產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳，溴乙啶染色。OD值行半定量檢測(cè)。 2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞株RAW264.7培養(yǎng)于含10％的小牛血清、100u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中

7、。培養(yǎng)液中加入終濃度為0、20、40、80、160、320ng/ml的rhG-CSF或rhGM-CSF。1×10<'5>個(gè)細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，6×10<'5>個(gè)細(xì)胞接種于100ml培養(yǎng)瓶。ELISA檢測(cè)培養(yǎng)液中MCP-1和MIP-1α的水平，操作分別按小鼠MCP-1 ELISA Kit(Pierce)和小鼠MIP-1α ELISA Kit(Biosource)說(shuō)明書進(jìn)行。 培養(yǎng)的RAW264.7細(xì)胞總RNA提取按Catrim

8、ox-14<'TM>RNA Isolation Kit Ver.2.11(TaKaRa公司)的說(shuō)明步驟進(jìn)行。RT-PCR擴(kuò)增參照TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0試劑盒操作說(shuō)明書進(jìn)行。PCR產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳，溴乙啶染色。OD值行半定量檢測(cè)。 按試劑盒說(shuō)明提取RAW264.7細(xì)胞總蛋白。為防止磷酸酶的激活，所有的步驟均在冰上進(jìn)行并加磷酸酶抑制劑。按BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行蛋白定量。等量蛋白

9、加樣于12％的聚丙烯酰胺凝膠后60mA下電泳，電轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。TTBS封閉1h，1：1，000抗CCR2抗體孵育，洗膜，1：5，000 HRP結(jié)合的兔抗羊IgG抗體孵育。內(nèi)參照GAPDH的檢測(cè)同上述方法。結(jié)果以DAB顯色，OD值行半定量檢測(cè)。 3.統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)根據(jù)具體資料采用F檢驗(yàn)、Dunnett檢驗(yàn)、tukey′S檢驗(yàn)或t檢驗(yàn)。以P值<0.05為差異有顯著

10、性。 結(jié)果： 1.外周血MNC計(jì)數(shù)術(shù)后第3、5和7d，與血栓組(1.7±0.2，1.5±0.3，1.3±0.4)比較，骨髓動(dòng)員組外周血MNC計(jì)數(shù)(rhG-CSF:2.1±0.3，3.1±0.2，4.4±0.3；rhGM-CSF：1.8±0.3，2.4±0.6，3.0±0.7)升高有顯著性差異。與rhGM-CSF骨髓動(dòng)員組比較，術(shù)后第5d(t=2.95，P<0.05)和7d(t=3.53，P<0.01)，rhG-CSF骨髓

11、動(dòng)員組升高有顯著性差異。 2.血栓機(jī)化率和電鏡結(jié)果術(shù)后7d和14d，與血栓組(15.6±2.3％，63.2±8.6％)比較，骨髓動(dòng)員組血栓的機(jī)化率(30.2±3.5％，89.5±5.6％)有顯著性差異(P<0.01)。骨髓動(dòng)員組中rhG-CsF和rhGM-CSF之間血栓機(jī)化率差異無(wú)顯著性。電鏡觀察顯示：與血栓組比較，骨髓動(dòng)員組(rhG-CSF或rhGM-CSF)，巨噬細(xì)胞數(shù)量多，其周圍常見新生幼稚血管和成熟再通血管，巨噬細(xì)胞吞噬

12、功能活躍。 3.巨噬細(xì)胞密度術(shù)后第7d，與血栓組血栓內(nèi)巨噬細(xì)胞密度(1.47±0.8％)比較，rhG-CSF骨髓動(dòng)員組(8.46±1.2％，P=0.0026)和rhGM-CSF骨髓動(dòng)員組(7.84±1.1％，P=0.0041)均顯著升高。術(shù)后第14d，血栓組血栓內(nèi)巨噬細(xì)胞密度為5.52±0.7％，rhG-CSF骨髓動(dòng)員組為13.52±1.3％(P=0.0087)，rhGM-CSF骨髓動(dòng)員組為12.13±1.4％(P=0.0092

13、)。術(shù)后第7d和14d，rhG-CSF和rhGM-CSF骨髓動(dòng)員組之間血栓內(nèi)巨噬細(xì)胞密度無(wú)顯著性差異。 4.MCP-1和MIP-1α水平大鼠外周血MCP-1和MIP-1α水平分別在術(shù)后7d和14d不同時(shí)點(diǎn)之間以及在相同時(shí)點(diǎn)不同組間均沒有顯著性差異。rhG-CSF或rhGM-CSF處理后，RAW264.7細(xì)胞分泌的MCP-1和MIP-1α水平?jīng)]有顯著性變化。 5.CCR2 mRNA表達(dá)與正常組比較，假手術(shù)組、血栓組和骨髓動(dòng)

14、員組術(shù)后7和14d CCR2mRNA水平顯著升高(P<0.05)。骨髓動(dòng)員組術(shù)后7和14d CCR2 mRNA水平均較血栓組顯著升高(P<0.05)。骨髓動(dòng)員組rhGM-CSF和rhGM-CSF之間CCR2 mRNA水平無(wú)顯著性差異。 80ng/ml rhGM-CSF或rhG-CSF對(duì)RAW264.7細(xì)胞CCR2 mRNA的表達(dá)促進(jìn)作用最強(qiáng)。RAW264.7細(xì)胞在80ng/ml rhGM-CSF或rhG-CSF培養(yǎng)363148h

15、后其CCR2 mRNA的表達(dá)穩(wěn)定增強(qiáng)，在培養(yǎng)12h后，rhGM-CSF對(duì)RAW264.7細(xì)胞CCR2 mRNA表達(dá)的促進(jìn)作用強(qiáng)于rhG-CSF。 6.CCR2蛋白表達(dá)80ng/ml rhGM-CSF對(duì)RAW264.7細(xì)胞CCR2蛋白的表達(dá)促進(jìn)作用最強(qiáng)。RAW264.7細(xì)胞在80ng/ml rhGM-CSF中分別培養(yǎng)36、48和60h后其細(xì)胞CCR2蛋白的表達(dá)逐漸增加。rhG-CSF對(duì)RAW264.7細(xì)胞CCR2蛋白的表達(dá)未見影響