調(diào)控內(nèi)皮祖細胞自噬對深靜脈血栓溶解再通作用的研究.pdf

1、深靜脈血栓形成(Deep venous thrombosis，DVT)是臨床常見血管外科疾病，可導(dǎo)致患肢深靜脈瓣膜功能不全、疼痛、反復(fù)腫脹、淺靜脈迂曲擴張、色素沉著、潰瘍及肢體壞死等，嚴(yán)重時可導(dǎo)致致死性的肺栓塞(pulmonary embolism，PE)。目前傳統(tǒng)的藥物抗凝和溶栓以及手術(shù)取栓治療可引起機體凝血功能下降、消化道出血、手術(shù)患者切口并發(fā)癥發(fā)生等并發(fā)癥，且遠期通暢率不理想，因此，如何更加有效的治療深靜脈血栓是血管外科醫(yī)生當(dāng)前極

2、為關(guān)注的研究方向。
　　骨髓來源的內(nèi)皮祖細胞(Bone marrow-derived endothelial progenitor cells BMEPCs)可以分化為血管內(nèi)皮細胞，并分泌各種促血管生成因子從而促進缺血組織的血管新生。相關(guān)研究證實，EPCs可以歸巢到深靜脈血栓中，進而促進血栓機化再通。但是由于血栓內(nèi)缺血缺氧的環(huán)境抑制EPCs的增殖、遷移和成血管等功能，因此如何更好的提高EPCs在缺氧環(huán)境下的功能成為其應(yīng)用于治療深靜

3、脈血栓的重點。
　　自噬是機體保留下來的高度保守的保護機制，與細胞的生長、繁殖，以及腫瘤的發(fā)生過程關(guān)系密切；它還是機體對外源性刺激如饑餓、缺氧、感染、藥物、生長因子及氧化應(yīng)激等的適應(yīng)性反應(yīng)，減少其對細胞產(chǎn)生的毒性作用。相關(guān)研究表明，自噬與細胞功能有緊密的聯(lián)系，如在缺血組織中，上調(diào)細胞自噬水平可抑制細胞的壞死和凋亡。上調(diào)自噬可通過激活磷酸化AKT通路，從而對牛動脈內(nèi)皮細胞的遷移和成血管功能具有明顯的促進作用，下調(diào)自噬則抑制其功能。長

4、時間的自噬會誘發(fā)細胞壞死和凋亡。查閱相關(guān)文獻，我們發(fā)現(xiàn)調(diào)控自噬水平對于EPCs的功能影響，特別在深靜脈血栓再通中的作用未見相關(guān)報道。
　　本研究的主要目的是探討自噬對內(nèi)皮祖細胞功能影響及促進靜脈血栓再通的作用，為深靜脈血栓的治療提供一種新的治療思路。分為四個部分，主要研究方法及結(jié)果如下。
　　第一部分大鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　目的：分離、培養(yǎng)并鑒定大鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細胞(endothelial pr

5、ogenitor cells，EPCs)。
　　方法：采用密度梯度離心方法分離SD（Sprague-Dawley）大鼠骨髓單個核細胞（BMMNCs），采用內(nèi)皮培養(yǎng)體系EGM-2培養(yǎng)基進行定向誘導(dǎo)分化培養(yǎng)14-21天，觀察細胞的生長形態(tài)變化，采用免疫組化、免疫熒光、流式細胞儀技術(shù)檢測造血干細胞表面標(biāo)記CD133及內(nèi)皮細胞表面標(biāo)記VEGFR、vWF，采用Matrigel成管實驗及DiI-ac-LDL攝取實驗檢測其成血管及吞噬功能。

6、r>　　結(jié)果：新分離的大鼠BMMNCs呈圓形，培養(yǎng)24-48h后可見其貼壁，細胞培養(yǎng)至第10～12天逐漸融合，并長滿培養(yǎng)瓶底，呈現(xiàn)典型“鋪路石或鵝卵石樣”外觀；DiI-ac-LDL攝取結(jié)果顯示培養(yǎng)細胞具有內(nèi)皮細胞吞噬DiI-ac-LDL的特性；Matrigel成管實驗可見細胞可形成血管腔樣結(jié)構(gòu)；流式細胞儀分析及免疫熒光檢測結(jié)果顯示，細胞高表達VEGFR、vWF等內(nèi)皮細胞標(biāo)記物，低表達或幾乎不表達CD133造血干細胞標(biāo)記物。
　　結(jié)

7、論：成功地建立了一套大鼠骨髓血管內(nèi)皮祖細胞分離、培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化及鑒定的方法體系。通過內(nèi)皮培養(yǎng)體系EGM-2的誘導(dǎo)培養(yǎng)，可從SD大鼠BMMNCs中獲得EPCs，培養(yǎng)到第14-21天的EPCs呈現(xiàn)晚期EPCs表型特征。
　　第二部分體外缺氧環(huán)境下自噬對內(nèi)皮祖細胞功能的影響
　　目的：探討自噬對大鼠EPCs增殖、遷移及成血管能力的影響，并探討其分子機制。
　　方法：分為三組，3-MA組（3-MA（+），3-MA（-））；AT

8、G5 siRNA組：將ATG5小干擾RNA（ATG5-siRNA）或陰性對照（NS）轉(zhuǎn)染到EPCs中；ATG5質(zhì)粒組：將ATG5質(zhì)粒（ATG5-pcDNA3.1）或陰性對照（pcDNA）轉(zhuǎn)染到EPCs中。各組EPCs于轉(zhuǎn)染24 h后或藥物處理20 h后于缺氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h（1％O2,5%CO2和94%N2，37℃），采用Rt-PCR及Western blot檢測各組EPCs中ATG5及Beclin-1的表達；采用MTT法檢測自噬對E

9、PCs增殖的影響；采用穿膜實驗檢測自噬對EPCs運動遷移能力的影響；采用matrigel管腔形成實驗檢測自噬對EPCs成血管能力的影響；采用Western blot檢測磷酸化AKT和非磷酸化AKT的表達水平。
　　結(jié)果：Rt-PCR及Western blot證實自噬抑制劑3-MA或ATG5-siRNA下調(diào)了EPCs中ATG5及Beclin-1的表達，而ATG5-pcDNA3.1則明顯上調(diào)了EPCs中ATG5及Beclin-1的表達

10、。MTT法、穿膜實驗及matrigel實驗說明上調(diào)自噬水平可促進缺氧環(huán)境下EPCs的增殖、遷移及成血管功能，而下調(diào)EPCs自噬水平則抑制其增殖、遷移及成血管功能。上調(diào)自噬促進EPCs功能的分子機制為激活磷酸化AKT。
　　結(jié)論：上調(diào)自噬水平可促進缺氧環(huán)境下EPCs的增殖、遷移及成血管功能。
　　第三部分 ATG5慢病毒表達載體的構(gòu)建及其在內(nèi)皮祖細胞中的穩(wěn)定表達
　　目的：構(gòu)建ATG5慢病毒表達載體pUbi-MCS-EG

11、FP-ATG5，然后感染EPCs，建立穩(wěn)定表達ATG5的EPCs細胞，利用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）驗證感染后ATG5在EPCs的顯著提高，為研究體內(nèi)條件下自噬對EPCs在深靜脈血栓再通中的作用奠定基礎(chǔ)。
　　方法：將聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增得到的ATG5前體序列pre-ATG5和慢病毒載體pUbi-MCS-EGFP經(jīng)酶切后連接產(chǎn)生pUbi-MCS-EGFP-ATG5，再與輔助包裝載體一起在293T細胞中包裝病毒，收集

12、病毒顆粒后感染EPCs。用qPCR方法檢測感染后的EPCs中ATG5的表達。
　　結(jié)果：慢病毒表達載體pUbi-MCS-EGFP-ATG5構(gòu)建成功，病毒顆粒感染EPCs后能有效提高EPCs中ATG5的表達。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建了pUbi-MCS-EGFP-ATG5慢病毒表達載體及穩(wěn)定表達ATG5的EPCs細胞系。
　　第四部分自噬對內(nèi)皮祖細胞在深靜脈血栓再通中的作用
　　目的：探討自噬對大鼠EPCs在深靜脈血栓機

13、化再通中的作用。
　　方法：使用慢病毒載體pUbi-MSC-EGFP/pUbi-MCS-EGFP-ATG5轉(zhuǎn)染EPCs，通過下腔靜脈結(jié)扎法構(gòu)建大鼠深靜脈血栓模型，再將轉(zhuǎn)染后的EPCs移植到大鼠血栓模型中，分別在術(shù)后7天、14天處死模型，取出血栓標(biāo)本。通過標(biāo)本稱重觀察血栓溶解情況；通過冰凍切片熒光示蹤觀察EPCs歸巢情況；通過HE染色觀察自噬對EPCs在深靜脈血栓機化中的作用；通過CD34免疫組化觀察自噬對EPCs在深靜脈血栓再通中

14、的作用。
　　結(jié)果：各組GFP陽性細胞數(shù)目比較：EPCs/ATG5組＞EPCs/vector組＞對照組，說明移植的EPCs可定向歸巢至深靜脈血栓中，上調(diào)EPCs中ATG5水平可顯著促進其歸巢能力；各組血栓重量比較：對照組＞EPCs/vector組＞EPCs/ATG5組，可見EPCs移植后可促進靜脈血栓溶解，上調(diào)EPCs中ATG5水平可顯著促進其溶栓能力；HE染色和CD34免疫組化提示EPCs移植后可促進血栓的機化再通，上調(diào)EPCs