肺結(jié)核患者血清小分子標(biāo)志蛋白分離鑒定的初步研究.pdf

1、結(jié)核病(tuberculosis，TB)是結(jié)核分枝桿菌所致的以呼吸系統(tǒng)感染為主的慢性傳染病。全球有1/3的人感染過結(jié)核(MTB)，每年有800萬新感染患者和300萬患者死亡，表明TB仍是影響全球人類健康的一個(gè)嚴(yán)重傳染病。然而目前結(jié)核的診斷技術(shù)不夠理想，尋找快速、簡(jiǎn)便、靈敏度和特異度高的結(jié)核桿菌的檢測(cè)方法，對(duì)結(jié)核病的預(yù)防和控制有著重大的意義。 表面增強(qiáng)激光解析離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(SELDI-TOF-MS)是近些年來建立的篩選血

2、清標(biāo)志蛋白的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法，具有高通量及高靈敏度，目前已用于多種腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)的研究。本研究前期工作已經(jīng)從肺結(jié)核患者和正常人血清中篩選出6個(gè)最具有診斷意義的肺結(jié)核血清標(biāo)志蛋白。利用這6個(gè)標(biāo)志蛋白建立診斷模型，區(qū)分TB與正常對(duì)照的分類準(zhǔn)確率98.33％，靈敏度96.67％，特異度100％，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值100％，陰性預(yù)測(cè)值96.77。但由于SELDI技術(shù)尚不能直接鑒定出標(biāo)志蛋白的序列，只能得出其分子量信息。因此，本研究目的是應(yīng)用各種技術(shù)分

3、離鑒定這些肺結(jié)核血清標(biāo)志蛋白。 目的： 1、通過改進(jìn)樣品處理、電泳條件、染色方法等，提高小分子蛋白(<10kD)在一維SDS-PAGE上的分辨率，以達(dá)到質(zhì)譜鑒定的要求。 2、應(yīng)用1D-SDS-PAGE電泳、切膠酶解和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜等技術(shù)方法進(jìn)一步分離、鑒定前期SELDI已篩選出來具有診斷價(jià)值的結(jié)核標(biāo)志蛋白，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。 方法： 1、分別應(yīng)用等電點(diǎn)沉淀法、乙腈沉淀法、Albumin/

4、IgGRemoval試劑盒去除血清中的中高豐度蛋白，再分別進(jìn)行電泳、蛋白濃度測(cè)定，觀察白蛋白的去除情況和目的蛋白的保留情況。 2、分別比較SDS-PAGE、Tricine-SDS-PAGE、4％-12％Bis-trisNuPAGE三種一維凝膠電泳(1D-PAGE)體系對(duì)處理過的血清樣品中小分子蛋白的分離效果，以及分離膠加入尿素、甘油，電壓，染色方法等電泳條件的優(yōu)化。 3、通過一維凝膠電泳發(fā)現(xiàn)、分離肺結(jié)核相關(guān)血清小分子標(biāo)志

5、蛋白，經(jīng)切膠酶解和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜鑒定目標(biāo)蛋白，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。 結(jié)果： 1、三種方法比較，乙腈沉淀法能在去除血清95％左右的高中豐度蛋白的同時(shí)收獲更多的15kD以下的小分子量蛋白；等電點(diǎn)沉淀法和Albumin/IgGRemoval試劑盒法都能去除血清大部分高豐度蛋白，使部分小分子蛋白得以顯現(xiàn)，后者能很特異地只去除占血清中蛋白總量75％以上的白蛋白和免疫球蛋白。 2.Tricine-SDS-PAGE能很

6、好地分離血清中的小分子蛋白，20kD以下的蛋白條帶清晰可見；分離膠中加入甘油或尿素能改善小分子蛋白的分離效果；銀染的靈敏度遠(yuǎn)高于膠體考染和常規(guī)考染，但在本實(shí)驗(yàn)中并沒有發(fā)現(xiàn)新的條帶。 3、應(yīng)用Tricine-SDS-PAGE電泳、切膠酶解和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜等技術(shù)鑒定出分子量為8778Da結(jié)核標(biāo)志蛋白很可能為ApolipoproteinA-II，序列覆蓋率為21％，有3個(gè)不重復(fù)的肽段得到鑒定，結(jié)果較為可靠。 4、生物信息

7、學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，載脂蛋白AII是一個(gè)分泌蛋白，它的一條氨基酸鏈含有77個(gè)(或76個(gè))氨基酸，MW=8707.9Da(或MW=8579.78)，pI=5.05，可能與目的蛋白8778Da的氨基酸序列相同。結(jié)核病的發(fā)生、發(fā)展與脂質(zhì)代謝方式密切相關(guān)，ApoA-Ⅱ又與脂質(zhì)代謝密不可分，ApoA-Ⅱ可能為結(jié)核比較特異的標(biāo)志物。 結(jié)論： 1、乙腈沉淀法能在去除血清絕大部分高中豐度蛋白的同時(shí)收獲更多的15kD以下的小分子量蛋白，適合于分離