基于蛋白組學的肺結(jié)核病及其中醫(yī)證候血清標志物篩選與鑒定.pdf

1、第一部分肺結(jié)核血清蛋白標志物的篩選、鑒定及診斷模型的建立
　　 研究背景:結(jié)核病(Tuberculosis，TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)引起的一種慢性傳染病。結(jié)核病疫情下降緩慢，肺結(jié)核(pulmonary tuberculosis，PTB)仍是影響全球特別是發(fā)展中國家公共衛(wèi)生的重大傳染疾病，急需新的策略提高肺結(jié)核的早期診斷質(zhì)量。生物標志物對于疾病的篩查、診斷、預(yù)后、療效判斷

2、以及檢測十分重要，因此，尋找更為靈敏的特征性的生物標志物是早期診斷肺結(jié)核的當務(wù)之急。蛋白組學技術(shù)的發(fā)展為從整體水平分析血清蛋白質(zhì)提供了技術(shù)平臺，表面加強激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(surface-enhancedlaser desorption ionization time of flight mass spectrometry, SELDI-TOF-MS)結(jié)合基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(matrix assisted laser

3、 desorption ionizationtime-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)、線性液質(zhì)聯(lián)用離子解串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(linear ion chromatograph mass spectrometry/mass spectrometry, LC-MS/MS)技術(shù)，作為全新的蛋白組學技術(shù)可實現(xiàn)對血清中特異性標志物的篩選和鑒定。
　　 研究方法:采用弱陽離子(weak cati

4、on exchange，WCX)磁珠結(jié)合SELDI-TOFMS技術(shù)建立180例初治繼發(fā)性肺結(jié)核患者和211例對照的血清蛋白指紋圖譜，應(yīng)用Biomarker Pattern Software(BPS)軟件建立肺結(jié)核的診斷模型。通過反相高效液相色譜(reverse phase-high performance liquid chromatography, RP-HPLC)分離及純化潛在的生物標志物蛋白，應(yīng)用MALDI-TOF MS跟蹤目標蛋

5、白，進一步用線性液質(zhì)聯(lián)用離子肼串聯(lián)質(zhì)譜(linear ion chromatograph mass spectrometry/massspectrometry, LC-MS/MS)進行分析，以鑒定潛在診斷標志物蛋白，并用酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)進行驗證。
　　 研究結(jié)果:120例肺結(jié)核和120例非肺結(jié)核(60例健康對照、20例肺癌、20例肺炎、20例慢性

6、阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD))血清蛋白圖譜比較，35個蛋白峰在肺結(jié)核和非肺結(jié)核組之間有顯著差異(P＜0.01，F(xiàn)old＞1.5)。篩選2554.6，4824.4，5325.7和8606.8m/z四個蛋白峰構(gòu)建了診斷模型Ⅰ，靈敏度為83.3％，特異度為84.2％，該模型顯示在肺結(jié)核臨床大規(guī)模的篩查具有較好的診斷能力，盲法檢驗靈敏度為75.0％，特異度為83.5％。以12

7、0例肺結(jié)核患者和60例肺結(jié)核其他疾病（肺癌、肺炎、COPD）篩選的差異峰為基礎(chǔ)構(gòu)建了由4180.1，5325.7，15103.6rn/z3個蛋白峰組成的診斷模型Ⅱ，靈敏度為87.5％，特異度為90.0％。該模型在臨床上對于有相似癥狀以及相似影像學改變的肺結(jié)核和其他肺部疾病的鑒別具有更強的應(yīng)用性，該模型盲法靈敏度為81.7％，特異度為85.0％，陽性預(yù)測值為84.5％。在肺結(jié)核中相對高表達的2554.6 m/z蛋白峰經(jīng)RP-HPLC分離純

8、化，并利用MALDI-TOF MS及LC-MS/MS進行鑒定，為纖維蛋白原（fibrinogen, alpha polypeptide isoform alpha-E preproprotein）的一個片段。血清ELISA實驗結(jié)果證實肺結(jié)核組的纖維蛋白原降解產(chǎn)物(fibrinogen degradationproduct，F(xiàn)DP)量均值高于健康對照組(5，005±1，297 vs.4，010±1，181 ng/mL，P＜0.05)，14

9、2例臨床隨機收集的肺結(jié)核病人血漿中的纖維蛋白原含量(5.45±1.65g/L)要高于正常值范圍(2.0-4.0 g/L)。
　　 結(jié)論:(1)建立納米磁珠結(jié)合SELDI-TOF MS的肺結(jié)核蛋白指紋圖譜檢測技術(shù)，可快速穩(wěn)定靈敏地構(gòu)建肺結(jié)核蛋白指紋圖譜;建立了RP-HPLC聯(lián)合MALDI-TOF MS、LC-MS/MS鑒定SELDI-TOF MS特異差異峰技術(shù)。(2)篩選了肺結(jié)核相關(guān)的差異蛋白峰，構(gòu)建了肺結(jié)核早期診斷的蛋白診斷模型

10、，為建立肺結(jié)核病臨床早期快速特異診斷的血清蛋白質(zhì)組學標準，提高肺結(jié)核病的防治水平奠定基礎(chǔ)。(3)鑒定和驗證了纖維蛋白原可能為肺結(jié)核早期診斷的潛在生物標志物之一，為臨床肺結(jié)核早期診斷奠定了基礎(chǔ)。
　　 第二部分肺結(jié)核中醫(yī)證候血清蛋白標志物的篩選、鑒定及診斷模型的建立
　　 研究背景:肺結(jié)核屬于中醫(yī)學“肺癆”范疇，目前用于肺結(jié)核治療的化學藥物雖有療效但毒副作用大且易形成耐藥性，而中醫(yī)基于患者機體正虛和癆蟲感染辨證施治，尤其是

11、近年來中西醫(yī)結(jié)合治療在耐藥肺結(jié)核和疑難重癥肺結(jié)核治療中取得了一定的療效。證候是中醫(yī)辨證施治的核心，肺結(jié)核中醫(yī)證候的診斷尚無科學量化的標準，嚴重影響臨床治療效果。蛋白質(zhì)組學技術(shù)的很多特征如整體性、動態(tài)性、時空性、復(fù)雜性等與中醫(yī)證候的特點十分吻合，以蛋白質(zhì)組為切入點，深入進行證候?qū)嵸|(zhì)的研究，有利于從微觀的角度動態(tài)地了解證候的物質(zhì)基礎(chǔ)，可為中醫(yī)證候診斷分型的客觀化提供依據(jù)。
　　 研究方法:采用中醫(yī)獨立四診辨證結(jié)合舌診儀脈診儀對180

12、例肺結(jié)核患者進行辨證分型，納入肺陰虛證(FYX)71例，陰虛火旺證(YXHW)64例，氣陰兩虛證(QYLX)45例。采用WCX磁珠結(jié)合SELDI-TOF MS技術(shù)建立血清蛋白指紋圖譜，應(yīng)用Biomarker Wizard軟件比較各證候間的差異峰并進行證候共性分析。應(yīng)用BPS軟件建立肺結(jié)核證候的辨證模型。通過RP-HPLC分離及純化潛在的生物標志物蛋白，應(yīng)用MALDI-TOF MS和LC-MS/MS進行分析，以鑒定潛在證候標志物蛋白，并用

13、蛋白芯片技術(shù)進行驗證。
　　 研究結(jié)果:50例FYX證、40例YXHW證、30例QYLX證血清蛋白指紋圖譜兩兩比較并作共性分析，F(xiàn)YX證與與其他兩證候比較均存在差異的蛋白峰有12個(P＜0.001)，YXHW證與其他兩證候比較均存在差異的蛋白峰有12個(P＜0.001)，QYLX證與其他兩證候比較均存在差異的蛋白峰有34個(P＜0.001）;有7個蛋白峰在三證間的含量呈肺陰虛→陰虛火旺→氣陰兩虛逐漸降低變化。以三證候間兩兩有差異

14、的74個差異峰(P＜0.001)為基礎(chǔ)構(gòu)建了由3961.7、4679.7、5646.4、8891.2、9416.7m/z5個蛋白標志峰組成的肺結(jié)核中醫(yī)證候蛋白質(zhì)指紋圖譜辨證模型，對于FYX證辨證的準確率為74.0％，對于YXHW證的準確率為72.5％，對于QYLX的準確率為96.7％。該模型對于肺結(jié)核三證候的分型具有較好的鑒別能力，盲法驗證對于FYX證辨證的準確率為76.2％，對于YXHW證的準確率為70.8％，對于QYLX的準確率為8

15、0.0％。對篩選到的蛋白差異峰進行了鑒定和抗體芯片的驗證，結(jié)果表明9416.7m/z蛋白峰是apolipoprotein C-Ⅲ載脂蛋白C-Ⅲ中的一段多肽。
　　 結(jié)論:(1)篩選歸納了肺結(jié)核各證候特有的差異蛋白峰，可能是證候外在表現(xiàn)的內(nèi)在病理機制和物質(zhì)基礎(chǔ)，為整體性評價肺結(jié)核中醫(yī)證候的實質(zhì)提供證據(jù);歸納了7個蛋白峰在三證間的含量呈肺陰虛→陰虛火旺→氣陰兩虛逐漸降低變化，結(jié)果與中醫(yī)理論關(guān)于肺結(jié)核證候病情演變相契合，差異的標志蛋白