貝特類藥物對大鼠肝臟APOA5表達的影響及APOA5的調(diào)脂機制探討.pdf

1、脂代謝異常的實質(zhì)是脂蛋白和載脂蛋白的異常，對致動脈粥樣硬化來說脂蛋白的作用要甚于膽固醇。載脂蛋白作為脂蛋白中的蛋白質(zhì)部分，不僅在結(jié)合和轉(zhuǎn)運脂質(zhì)、穩(wěn)定脂蛋白的結(jié)構(gòu)上發(fā)揮重要作用，而且還具有調(diào)節(jié)脂蛋白代謝關(guān)鍵酶的活性，參與脂蛋白受體的識別的作用，它參與了人體脂類代謝的全過程。20年前鑒定發(fā)現(xiàn)了已知在脂代謝中有重要作用的大多數(shù)載脂蛋白，他們中的9個(APOAl，APOA2，APOA4，APOB48，APOB100，APOC1，APOC2，AP

2、OC3，和APOE)是與脂蛋白調(diào)節(jié)最相關(guān)的。還有一些載脂蛋白是最近才發(fā)現(xiàn)的，它們在脂蛋白代謝中的作用仍是未知的。載脂蛋白A5(APOA5)是在2001年通過蛋白組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)的一個新的載脂蛋白家族成員，被認為是在甘油三酯(TG)生物學(xué)的一個重大發(fā)現(xiàn)。研究載脂蛋白A5的等位基因1131T>C和19S>W發(fā)現(xiàn)，與1131T攜帶者和19S攜帶者相比，1131C攜帶者和19W的攜帶者有較高的血清甘油三酯濃度。載脂蛋白多態(tài)性研究顯示APOA5具有降

3、低血漿甘油三酯的調(diào)脂保護作用，但因為它的血漿濃聚物大約只是其它載脂蛋白(如APOA1和APOA2)的千分之一，所以APOA5的關(guān)聯(lián)性和功能不能直接充分地被發(fā)現(xiàn)。最近的一些研究認為，APOA5降低甘油三酯是通過脂蛋白脂肪酶(LPL)的激活和加速極低密度脂蛋白(VLDL)的分解代謝實現(xiàn)的，對人類APOA5基因的進一步研究發(fā)現(xiàn)，一些轉(zhuǎn)錄因子(如PPARa，RORa，LXR和SREBP-1c等)有調(diào)節(jié)其降脂的作用。貝特類調(diào)血脂藥經(jīng)典的作用是降低

4、甘油三酯，其調(diào)控脂代謝相關(guān)基因表達主要是通過PPARα實現(xiàn)的，APOA5是否參與了貝特類藥物調(diào)節(jié)甘油三酯的作用，其具體作用機制如何，是否與PPAR-α的調(diào)節(jié)有關(guān)，目前國內(nèi)外報道甚少。對APOA5調(diào)節(jié)脂代謝的機制深入研究，將為改善脂代謝異常提供新的途徑，對冠心病等心血管疾病的一級預(yù)防提供新的思路。 目的： 1．通過復(fù)制高甘油三酯血癥的動物模型，并用不同劑量的非諾貝特(貝特類藥物)進行干預(yù)，分析非諾貝特對大鼠肝臟APOA5m

5、RNA表達的影響及APOA5與LPL活性、PPAR-α及血脂各項指標的關(guān)系，旨在探討APOA5在貝特類藥物調(diào)脂中的作用機制。 2．通過檢測冠心病患者血清APOA5以及其他血脂、脂蛋白水平，探討血清APOA5水平與血脂及冠心病的相關(guān)性，進一步探討APOA5調(diào)節(jié)血脂的機制及其在冠心病發(fā)病中的作用。 研究方法 (分為兩部分)： ①基礎(chǔ)研究部分：40只雄性wister 大鼠，用普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，頸靜脈竇采血測定基

6、線血清TC、TG(以酶法測定)HDL-C、LDL-C水平(以直接勻相法測定)均在全自動生化分析儀上進行，隨機分為4組(對照組、高脂組、非諾貝特低劑量組和非諾貝特高劑量組)，對照組飼以普通飼料，其余3組飼以高脂飼料。分組喂養(yǎng)4周后再次抽血測定血清TC、TG、HDL-C、LDL-C等指標。然后給予藥物干預(yù)，對非諾貝特高、低劑量組每日分別以非諾貝特100mg/kg，35mg/kg灌胃，其余組以生理鹽水灌胃。藥物干預(yù)4周后，第3次取血檢測TC、

7、TG、HDL-C和LDL-C，用比色法測定LPL活性，處死大鼠，取肝臟抽提t(yī)uRNA并應(yīng)用RT-PCR檢測APOA5及PPAR-α表達情況，制備肝勻漿測定TC和TG(測定方法同上)，比較APOA5與各項指標的相關(guān)性。 ②臨床研究部分：選擇經(jīng)冠狀動脈造影證實的67例冠心病患者和107例健康對照者為研究對象，均在清晨空腹自肘靜脈采血5ml，留取血清。其中1ml血清于-80℃保存用于APOA5和脂聯(lián)素的測定，其余血清當(dāng)日送檢驗科用全

8、自動生化儀進行血脂、脂蛋白和血糖檢測。APOA5的測定方法是先用離心濃縮機系統(tǒng)濃縮血清，而后采用ELISA法測定；脂聯(lián)素的測定采用ELISA法。系統(tǒng)分析血清APOA5水平、脂聯(lián)素水平與血脂、脂蛋白的相關(guān)性。 ③統(tǒng)計學(xué)處理：全部數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理，所有數(shù)據(jù)以x±s表示，組結(jié)果： 1．基礎(chǔ)部分：(1)不同處理組間血脂水平在基線時測定值均無統(tǒng)計學(xué)差異。分組喂養(yǎng)4周后高脂組及非諾貝特高、低劑量組的血清TC、TG和

9、LDL水平較基線測定值及正常對照組升高，而HDL降低(p<0.05)；正常對照組與基線測定值比較沒有明顯變化。(2)藥物處理4周后，高脂組大鼠的血清TG、TC較藥物處理前明顯升高(p<0.01)，并較正常對照組大鼠明顯升高(p<0.01)，而預(yù)先給予非諾貝特高、低劑量均顯著降低已形成高脂血癥大鼠的血清TG水平(p<0.05)，成劑量依賴性，并且不同程度的降低血清TC、LDL水平及升高HDL，在肝臟勻漿中也表現(xiàn)出相同的結(jié)果。(3)高脂組大

10、鼠的肝臟APOA5mRNA表達較正常對照組大鼠下降(p<0.01)，而非諾貝特則顯著增加高脂血癥大鼠的肝臟APOA5及PPAR α的mRNA表達，并顯著增加血漿LPL的活性，呈劑量依賴性。非諾貝特高劑量組的血清TG，APOA5和PPAR α的mRNA表達及LPL活性均與正常對照組沒有明顯差異。(4)APOA5mRNA表達與血清和肝勻漿中TG含量變化呈明顯負相關(guān)(p<0.01)，APOA5與PPAR α mRNA表達呈正相關(guān)(p<0.01

11、)，APOA5與血清LPL活性呈正相關(guān)(p<0.05)。APOA5與血清及肝勻漿TC含量、HDL、LDL無明顯相關(guān)性(p>0.05)。 2．臨床實驗：①與對照組比較，冠心病組的APOA5及APN水平明顯降低；TC、TG和LDL-C均明顯升高(p<0.01或p<0.05)；而HDL-C、Glu水平?jīng)]有顯著性差異(p>0.05)。②將CHD患者分為高TG組和正常TG組后進行分析，結(jié)果顯示兩組CHD患者的血清APOA5值都明顯低于正

12、常對照組(p<0.01)，而且CHD高TG組血清APOA5還明顯低于CHD正常TG組(p<0.01)；兩組CHD患者血清ANP值都明顯低于對照組的血清ANP值(p<0.01)，而且CHD高TG組血清ANP還明顯低于CHD正常TG組(p<0.05)。③把全部研究對象按血脂水平分組比較發(fā)現(xiàn)：與正常TG組比較，高TG組的APOA5濃度明顯的降低(p<0.01)；而高TC組和正常TC組間APOA5濃度無統(tǒng)計學(xué)差異。④血清APOA5水平與脂聯(lián)素呈

13、顯著正相關(guān)(p<0.01)，與血清TG、LDL之間呈顯著負相關(guān)(p<0.01和p<0.05)；血清脂聯(lián)素與TG、TC呈顯著負相關(guān)(p<0.01)，血．清脂聯(lián)素水平與血清HDL呈正相關(guān)(p<0.05)。 結(jié)論： 1．非諾貝特能夠誘導(dǎo)肝臟PPAR α和APOA5 mRNA表達量增高，呈劑量依賴性。非諾貝特調(diào)控血脂至少部分是通過PPAR α調(diào)控APOA5實現(xiàn)的。APOA5基因表達與LPL的活性有明顯的相關(guān)性。APOA5基因的表