HDL和apoA-I模擬肽對脂肪細胞分泌功能的影響及其機制探討.pdf

1、背景:動脈粥樣硬化性疾病是嚴重危害人類健康的主要疾病。肥胖是冠心病的獨立危險因素，而脂肪細胞的功能改變是引起肥胖的核心因素，因此，研究脂肪細胞的功能對于肥胖、冠心病的防治具有重要意義。脂肪細胞的功能越來越受到重視，并得到重新認識，目前認為脂肪細胞功能改變與動脈粥樣硬化密切相關。 脂肪組織是體內最大的能量儲存器官，脂肪細胞的主要功能是以甘油三酯的形式儲存過多的能量；此外，脂肪細胞還具有重要的內分泌功能，可以分泌一系列脂肪因子，其中

2、很多與動脈粥樣硬化的發(fā)病機制有關。脂肪組織可通過分泌各種促炎性的脂肪因子，進而引起全身的慢性炎癥反應狀態(tài)。脂聯(lián)素是由脂肪組織特異性分泌的一種炎癥相關性蛋白質，目前認為脂聯(lián)素是胰島素抵抗、糖尿病和動脈粥樣硬化的保護性因子。炎性細胞因子腫瘤壞死因子-α(TNFα)水平升高與動脈粥樣硬化的嚴重性密切相關，脂肪細胞是體內內源性TNFα的重要來源之一。單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)是單核細胞強有力的趨化因子，也是動脈粥樣硬化反應的促發(fā)信號，脂

3、肪細胞可在多種刺激物的誘導下產(chǎn)生MCP-1。 脂多糖(LPS)是一種公認的炎癥刺激物。低密度脂蛋白(LDL)經(jīng)過氧化修飾后具有致動脈粥樣硬化作用，而氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)除了參與形成泡沫細胞外，還在局部慢性炎癥反應中起一定的作用。與oxLDL相反，高密度脂蛋白(HDL)被認為具有抗動脈粥樣硬化及心血管保護作用，但其具體機制尚不十分清楚。研究已經(jīng)證實，HDL參與調節(jié)脂肪細胞內脂質代謝，但HDL對脂肪細胞炎癥反應的調節(jié)尚未

4、見報導。有研究提示，HDL的主要載脂蛋白之一載脂蛋白A-I(apoA-I)和apoA-I模擬肽是有效的抗炎劑并可能對動脈粥樣硬化具有臨床治療潛能，但是apoA-I模擬肽對脂肪細胞是否也具有抗炎作用尚不為人所知。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)是主要表達于脂肪組織的一種核受體。核因子kB(NF-kB)調控多種細胞因子的轉錄，參與了動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的多個步驟，在動脈粥樣硬化中起重要作用。CCAAT/增強子結合蛋白(C/EBPs

5、)是NF-kB以外的另一類重要的細胞核轉錄調控因子。目前的研究顯示，PPARγ、NF-kB或C/EBPs均不同程度地參與了某些細胞因子的轉錄調控，其可能也部分地參與調控脂肪細胞脂肪因子的轉錄與分泌，但具體作用及信號通道仍須進一步的研究。 目的:觀察HDL和apoA-I模擬肽L-4F對炎癥狀態(tài)下3T3-L1脂肪細胞脂聯(lián)素、TNF α及MCP-1的上清液濃度及其mRNA表達的影響，并探討其可能的作用機制。 方法: 3

6、T3-L1脂肪細胞促分化成熟后，分成三組：(1)LPS刺激組：脂多糖(LPS)刺激脂肪細胞處于炎癥狀態(tài)，給予不同濃度的HDL(10-100μg/ml)和L-4F(1-50μg/ml)干預，收集細胞和培養(yǎng)上清液，測定細胞上清液脂聯(lián)素濃度，脂肪細胞脂聯(lián)素和PPARγmRNA表達水平，及NF-kB活性。(2)oxLDL刺激1小時組：oxIDL刺激脂肪細胞1小時，給予不同濃度的HDL(10-100μg/ml)和阿托伐他汀(0.1-10μM)，及

7、H-89(10μM)+HDL(100μg/ml)干預，收集細胞，測定脂肪細胞TNFα和PPARγmRNA表達水平，IkB蛋白濃度及NF-kB活性。(3)oxLDL刺激不同時間組：oxLDL分別刺激脂肪細胞1、6、12小時，給予不同濃度的HDL(10-100μg/ml)、L-4F(1-50μg/ml)，H-89(10μM)及H-89+FHDL(100μg/ml)或H-89(10μM)+L-4F(50μg/ml)干預，收集細胞，測定脂肪細胞

8、MCP-1上清液中的濃度和mRNA表達水平，以及脂肪細胞核因子C/EBPα、β的蛋白表達水平；改良Boyden小室法檢測不同干預組上清液對人外周血單核細胞趨化活性的影響。 結果: 1.LPS刺激分化成熟的3T3-L1脂肪細胞使其脂聯(lián)素分泌和mRNA表達水平分別下降44％和60％(P<0.05)。 2.HDL和L-4F濃度依賴性上調炎癥狀態(tài)下3T3-L1脂肪細胞脂聯(lián)素的分泌及表達。10、50和100μg/ml HD

9、L分別使脂聯(lián)素水平升高1倍、1.9倍和3.2倍(P<0.05)，1、10,50μg/ml L-4F分別使脂聯(lián)素水平升高1.2倍、2.9倍和3.4倍(P<0.05)。與LPS刺激組(0.36±0.05)比較，10、50、100μg/ml HDL分別使脂聯(lián)素mRNA表達升高至0.72±0.13、1.05±0.15、1.51±0.11，而1、10、50μg/m L-4F分別使脂聯(lián)素mRNA表達升高至0.79±0.12、1.40±0.18、1.

10、58±0.10(P均<0.05)。 3.PPARγ在分化成熟的3T3-L1脂肪細胞有較高水平的表達，與LPS刺激組比較，PPARγ表達在HDL和L-4F干預后明顯升高(2.85±0.69 vs 0.38±0.19，2.92±0.96 vs 0.38±0.19；P<0.05)，而NF-kB活性在HDL和L-4F干預后明顯降低(0.48±0.09 vs 1.93±0.59，0.43±0.08 vs 1.93±0.59：P<0.05)

11、。 4.OxLDL(50μg/ml)刺激1小時使3T3-L1脂肪細胞TNFα分泌(2.98±1.10 pg/ml vs 8.93±3.26 pg/ml，P<0.001)、mRNA表達(0.218±0.078 vs 0.633±0.157，P<0.001)及NF-kB活性(1.54±0.44 vs4.08±0.87.P<0.05)明顯增強。 5.阿托伐他汀濃度依賴性降低TNF α分泌及mRNA表達，抑制NF-kB活化，并增

12、強PPARγmRNA表達。10μM阿托伐他汀使脂肪細胞oxLDL誘導的TNFα mRNA表達降低56.5％，NF-kB活性減少41.2％，而使PPARγmRNA表達增加至2.83倍。HDL也呈濃度依賴性抑制TNF α分泌及mRNA表達，NF-kB活化和IkB降解。與oxLDL刺激組比較，100μg/ml HDL使TNFα mRNA表達降低64.5％，NF-kB活性減少49％，并明顯增加IKB蛋白水平，但對PPARγmRNA表達無影響。H

13、DL的這些抗炎效應能被蛋白激酶A(PKA)抑制劑H-89部分抑制。 6.OxLDL(50μg/ml)刺激12小時使脂肪細胞上清液中MCP-1的濃度和表達增加至2.13倍，并使得誘導的單核細胞移動距離明顯增力口(69.88±8.19 μm vs 136.75±8.03 μm，P<0.001)。 7.L-4F和HDL均以濃度依賴的方式減少脂肪細胞MCP-1的表達分泌，降低單核細胞趨化活性。50μg/ml L-4F和100Bg

14、/ml HDL分別使MCP-1的表達分泌降低91±6％和79±7％(P<0.001)。PKA抑制劑H-89(10μM)干預oxLDL刺激的脂肪細胞后MCP-1 m RNA的表達也顯著減少71±7％(P<0.001)，但是，在100μg/ml HDL或50μg/ml L-4F作用的基礎上，H-89(10μM)的孵育并未使得MCP-1mRNA的表達進一步降低(P>0.05)。 8.50μg/ml oxLDL刺激對脂肪細胞C/EBP

15、α的表達無明顯影響，但增加C/EBPβ蛋白量，該作用呈時間依賴性；H-89、L-4F和HDL干預均降低脂肪細胞C/EBPβ的蛋白表達量。 結論: 1.LPS和oxLDL均能誘導分化成熟的3T3-L1脂肪細胞產(chǎn)生炎癥狀態(tài)，使其表達和分泌脂聯(lián)素水平下降，使TNFα及MCP-1的表達和分泌增強。 2.HDL和L-4F能上調LPS刺激炎癥狀態(tài)下脂肪細胞脂聯(lián)素的表達和分泌，PPARγ和NF-kB可能參與了HDL和L-4F上

16、調脂聯(lián)素的效應過程。 3.阿托伐他汀通過NF-KB和PPARy途徑抑制oxIDL誘導的3T3-L1脂肪細胞TNFα分泌及mRNA表達。 4.HDL能抑制oxLDL誘導的3T3-L1脂肪細胞TNFα分泌和mRNA表達，其抗炎作用強度與阿托伐他汀相似。PKA-IKB-NF-KB信號通路是其中作用途徑之一，該效應不需要HDL與oxLDL的直接接觸作用。 5.OxLDL時間依賴性地誘導脂肪細胞C/EBPβ的蛋白表達。