多沙唑嗪對映體在動物心血管系統(tǒng)的手性藥理學研究.pdf

1、多沙唑嗪(doxazosin，DOX)是一種喹唑啉類的長效選擇性α1受體阻滯劑，是治療良性前列腺增生(BPH)所致下尿路癥狀的一線用藥[1]，同時可擴張容量及阻力血管，具有良好的降壓作用。但是，在抗高血壓和降脂治療預防心肌梗死的大規(guī)模臨床試驗(Antihypertensiveandlipid-loweringtreatmenttopreventheartattacktrial，ALLHAT)中，多沙唑嗪組出現(xiàn)了較多的心血管事件而提前退出

2、了臨床試驗[2]。為了降低多沙唑嗪的不良反應，人們著手對其手性對映體進行研究。阿夫唑嗪（alfuzosin，ALF）與DOX同屬喹唑啉類高選擇性α1受體阻斷藥，DOX及ALF的分子結構中均存在一個手性碳原子，因此，DOX和ALF分別存在(-)DOX、(+)DOX、(-)ALF和(+)ALF四個對映體，臨床應用二者的消旋體[（±）DOX和（±）ALF]。目前關于（±）DOX和（±）ALF及其對映體對離體心臟的作用尚不甚清楚。一般認為，心功

3、能受損時導致激素與促炎細胞因子分泌水平可反應心臟收縮功能。腦利鈉肽(BNP)、核因子-κB(NF-κB)及白細胞介素-6（IL-6）均是心力衰竭發(fā)生的生物學標志物。本研究采用小鼠離體心房組織，觀察（±）DOX、（±）ALF及其對映體對心肌收縮力和心率的影響;并觀察了長期給予多沙唑嗪及其對映體對大鼠血漿氨基末端原腦利鈉肽(NT-proBNP)、NF-κB及IL-6水平的不同影響。
　　 多種信號途徑可能參與藥物誘發(fā)的心肌收縮力改變

4、，為進一步探討DOX及其光學異構體對心肌收縮力不同影響的機制，本研究使用大鼠離體心房肌標本，研究了酚芐明、阿托品及普萘洛爾、吲哚美辛、維拉帕米、亞甲藍、H-89等不同阻斷劑對多沙唑嗪對映體引起大鼠張力反應的影響。
　　 血漿蛋白結合在藥物治療中起著重要的作用。藥物與血漿蛋白結合的變化顯著地影響它的藥代動力學和藥效學。因為對映體之間的蛋白結合率往往造成它們藥代動力學的差異。對映體蛋白結合的立體選擇性的研究對于理解其藥理學、臨床療效

5、及安全性是必不可少的。因此，有必要對生理條件下多沙唑嗪對映體的立體選擇性進行研究。本研究采用手性固定相柱聯(lián)合平衡透析法同時測定大鼠、狗和人血漿中加入消旋多沙唑嗪后其每一對映體的蛋白結合率。結果表明，多沙唑嗪對映體對大鼠，狗和人類血漿蛋白結合具有立體選擇性，且種屬間也存在差異。
　　 第一部分，多沙唑嗪對映體對心率、心肌收縮力及心衰生物學標志物的影響
　　 本研究采用小鼠離體心房組織，觀察（±）DOX及其兩種對映體、（±）

6、ALF及其兩種對映體對小鼠離體心房心肌收縮力和心率的影響;并觀察多沙唑嗪及其對映體長期給藥對大鼠血漿氨基末端原腦利鈉肽(NT-proBNP)、IL-6及NF-κB水平的不同影響，以期為喹唑啉類α1受體阻斷藥的臨床安全用藥和新藥設計提供實驗數(shù)據(jù)。
　　 1、(±)DOX和（±）ALF及二者的對映體誘發(fā)小鼠離體右心房停搏反應
　　 (+)DOX組的16例標本中，加入30μmol·L-1藥物后，5例發(fā)生停搏反應;停搏率為31.

7、3％。（±）DOX組和(-)DOX組分別在10μmol·L-1和30μmol·L-1濃度時，各有一例發(fā)生停搏反應。(-)ALF、(+)ALF、（±）ALF組和溶劑對照組，未發(fā)生停搏反應。
　　 2、(±)DOX和（±）ALF及二者的對映體對小鼠離體右心房心率的影響
　　 各組離體右心房心率的藥前值相同(P＞0.05)，溶劑對小鼠離體右心房心率無顯著影響（P＞0.05）。(+)DOX和（±）DOX各濃度均顯著減慢小鼠右心房

8、心率(P＜0.01)，并具有濃度依賴關系;30μmol·L-1的(+)DOX和（±）DOX組小鼠心率減慢率分別為（83.47±12.23）％和（74.97±15.66）％，3μmol·L-1(+)DOX減慢心率的作用顯著強于同濃度（±）DOX(P＜0.01)。(-)DOX（3μmol·L-1）對離體右心房心率無顯著影響(P＞0.05)，且(-)DOX在10和30μmol·L-1濃度時減慢心率的作用顯著弱于同濃度(+)DOX(P＜0.01

9、)。(-)ALF和(+)ALF（10和30μmol·L-1）顯著減慢小鼠心率，30μmol·L-1時小鼠心率分別減慢（13.05±7.27）％和（14.27±9.75）％;（±）ALF僅在30μmol·L-1濃度顯著減慢小鼠心率，三者抑制心率的作用強度相同。
　　 3、(±)DOX和（±）ALF及二者的對映體對小鼠離體左心房收縮力的影響
　　 各組左心房心肌收縮力的藥前值相同(P＞0.05)，溶劑對小鼠離體左心房心肌收縮

10、力無顯著影響(P＞0.05)。(±)DOX和(-)DOX(3、10和30μmol·L-1)顯著增強小鼠離體左心房心肌收縮力(P＜0.05)，并具有濃度依賴關系;(-)DOX（10和30μmol·L-1）的正性肌力作用顯著強于同濃度（±）DOX的作用(P＜0.05)。相反，(+)DOX具有輕度但顯著的負性肌力作用(P＜0.05)。（±）ALF及其對映體（3、10和30μmol·L-1）對小鼠離體左心房心肌收縮力無顯著影響(P＞0.05)。

11、
　　 4、(-)DOX、(+)DOX及（±）DOX長期給藥對大鼠血漿NT-proBNP濃度的影響
　　 溶劑對照組、(-)DOX組、(+)DOX組及（±）DOX組血漿NT-proBNP濃度分別為475.55±150.21ng·L-1、635.00±343.52ng·L-1、375.55±127.09ng·L-1及424.12±134.19ng·L-1。(+)DOX組及（±）DOX組血漿NT-proBNP濃度低于對照組，

12、但組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。(-)DOX組血漿NT-proBNP值高于對照組，但組間比較差異亦無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。(-)DOX組血漿NT-proBNP濃度高于(+)DOX組(P＜0.05)。
　　 5、(-)DOX、(+)DOX及（±）DOX長期給藥對大鼠血漿NF-κB濃度的影響
　　 溶劑對照組、(-)DOX組、(+)DOX組及（±）DOX組血漿NF-κB濃度分別為888.46±343.36n

13、g·L-1、705.77±193.34ng·L-1、1140.00±365.26ng·L-1及910.38±276.39ng·L-1。(+)DOX組及（±）DOX組血漿NF-κB濃度高于溶劑對照組，但組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。(-)DOX組血漿NF-κB濃度高于溶劑對照組，但組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。(-)DOX組血漿NF-κB值低于(+)DOX組(P＜0.05)。
　　 6、(-)DOX、(+)

14、DOX及（±）DOX長期給藥對大鼠血漿IL-6濃度的影響
　　 溶劑對照組、(-)DOX組、(+)DOX組及（±）DOX組血漿IL-6濃度分別為48.81±23.39ng·L-1、75.13±21.58ng·L-1、59.44±23.17ng·L-1及70.19±37.44ng·L-1。單因素方差分析結果顯示:與溶劑對照組比較，各藥物組大鼠血漿IL-6水平無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 研究結果表明，DOX對小鼠離

15、體心房的心率和心肌收縮力具有明顯的影響，高濃度尚可誘發(fā)心臟停博反應;DOX的手性結構對其上述活性具有明顯的影響。相反，ALF僅輕度抑制小鼠心率，ALF的手性結構對其心臟效應無明顯影響。長期灌胃給予DOX及其對映體未顯著影響大鼠心衰生物學標志物NT-proBNP及IL-6的血漿濃度;但是，(+)DOX組大鼠的血漿NF-κB水平顯著高于(-)DOX組，提示(+)DOX對機體免疫及炎癥反應有一定的影響。
　　 第二部分，多沙唑嗪對映體

16、誘發(fā)大鼠心房肌收縮力變化的作用機制
　　 本研究采用大鼠離體心房組織研究了酚芐明、阿托品及普萘洛爾、吲哚美辛、維拉帕米、亞甲藍、H-89等不同阻斷劑對多沙唑嗪對映體引起大鼠張力反應的影響。
　　 1、(-)DOX、(+)DOX對離體大鼠左心房心肌張力的影響
　　 溶劑對大鼠心肌張力無顯著影響;(-)DOX顯著增強大鼠左心房心肌收縮力，3、10、30μmol·L-1的(-)DOX增強大鼠心肌收縮力的百分比分別為(5

17、.57±20.95)、(6.96±39.77)％、(67.46±30.09)％。(+)DOX顯著抑制大鼠左心房心肌收縮力，3、10、30μmol·L-1的(+)DOX抑制大鼠心肌收縮力的百分比分別為(-15.61±14.15)％、(-36.99-±23.58)％、(-57.48±56.01)％。
　　 2、阿托品及普萘洛爾對DOX對映體改變大鼠心房收縮力的影響
　　 以阿托品及普萘洛爾預處理標本后，溶劑對大鼠心肌張力無顯

18、著影響。(-)DOX顯著增強大鼠左心房心肌收縮力），3、10、30μmol·L-1的(-)DOX增強大鼠心房收縮力的百分比分別為（13.02±16.66）％、（53.65±41.02）％、（70.87±52.66）％。(+)DOX顯著抑制大鼠左心房心肌收縮力，(+)DOX抑制大鼠心房收縮力的百分比分別為(-8.02±21.43)％、(-21.60±21.50)％、(-63.75±24.14)％。
　　 3、酚芐明對DOX對映體改

19、變大鼠心房收縮力的影響
　　 以酚芐明預處理標本后，溶劑對大鼠心肌張力無顯著影響。(-)DOX顯著增強大鼠左心房心肌收縮力，3、10、30μmol·L-1的(-)DOX增強大鼠心房收縮力的百分比分別為(13.71±14.39)％、(35.48±11.90)％、（71.62±37.20）％。(+)DOX顯著抑制大鼠左心房心肌收縮力，3、10、30μmol·L-1的(+)DOX抑制大鼠心房收縮力的百分比分別為(-14.08±23.4

20、8)％、(-33.08±17.85)％、(-60.73±17.21)％。以乙醇預處理標本后，溶劑對大鼠心肌張力無顯著影響。(-)DOX顯著增強大鼠左心房心肌收縮力，3、10、30μmol·L-1(-)DOX對增強大鼠心房收縮力的百分比分別為（19.05±7.14）％、（49.27±28.71）％、（71.21±35.57）％。(+)DOX顯著抑制大鼠左心房心肌收縮力，(+)DOX抑制大鼠心房收縮力的百分比分別為（-10.40±14.76

21、）％、(-23.73±26.18)％、(-65.63±6.52)％。
　　 4、吲哚美辛對DOX對映體改變大鼠心房收縮力的影響
　　 以吲哚美辛預處理標本后，溶劑對大鼠心肌張力無顯著影響。(-)DOX顯著增強大鼠左心房心肌收縮力，3、10、30μmol·L-1的(-)DOX增強大鼠張力的百分比分別為(19.87±13.06)％、(55.73±18.00)％、（60.25±35.25）％。(+)DOX顯著抑制大鼠左心房心肌

22、收縮力，3、10、30μmol·L-1的(+)DOX抑制大鼠心房收縮力的百分比分別為（-7.23±13.39）％、（-31.33±18.74）％、（-70.42±8.90）％。以乙醇預處理標本后，(-)DOX顯著增強大鼠左心房心肌收縮力，(-)DOX對大鼠張力的增強率為(21.01±9.75)％、(43.88±28.26)％、(59.45±24.87)％。(+)DOX顯著抑制大鼠左心房心肌收縮力，(+)DOX抑制大鼠心房收縮力的百分比分

23、別為(-15.21±13.14)％、(-29.28±23.55)％、(-66.55±6.13)％。
　　 5、維拉帕米對DOX對映體改變大鼠心房收縮力的影響
　　 以維拉帕米預處理標本后，溶劑對大鼠心肌張力無顯著影響。(-)DOX顯著增強大鼠左心房心肌收縮力，3、10、30μmol·L-1的(-)DOX增強大鼠張力的百分比分別為(24.81±20.49)％、(75.98±23.00)％、（131.15±17.56）％。(

24、+)DOX顯著抑制大鼠左心房心肌收縮力，(+)DOX抑制大鼠心房收縮力的百分比分別為（-9.60±17.19）％、(-33.47±9.43)％、(-72.23±14.65)％。
　　 6、亞甲藍對DOX對映體改變大鼠心房收縮力的影響
　　 以亞甲藍預處理標本后，溶劑對大鼠心肌張力無顯著影響。(-)DOX顯著增強大鼠左心房心肌收縮力，3、10、30μmol·L-1的(-)DOX增強大鼠張力的百分比分別為（36.26±9.8

25、2）％、（65.99±26.27）％、（16.02±35.33）％。3、10、30μmol·L-1的(+)DOX抑制大鼠心房收縮力的百分比分別為（-5.57±17.32）％、（-10.54±25.09）％、(-58.27±15.47)％。
　　 7、H-89對DOX對映體改變大鼠心房收縮力的影響
　　 以H-89預處理標本后，溶劑對大鼠心肌張力無顯著影響。(-)DOX顯著增強大鼠左心房心肌收縮力，3、10、30μmol·

26、L-1的(-)DOX增強大鼠心肌張力的百分比分別為(28.96±9.49)％、(81.93±20.75)％、(101.53±51.95)％。(+)DOX顯著抑制大鼠左心房心肌收縮力，(+)DOX抑制大鼠心房收縮力的百分比分別為（-17.71±16.37）％、(-30.76±18.38)％、(-67.67±10.74)％。
　　 研究結果表明，(-)DOX增強大鼠心房肌收縮力的作用，可能與心肌α受體、M膽堿受體、β受體以及環(huán)氧合酶

27、無關;L型Ca2+通道、細胞內cGMP以及PKA可能在某種程度上參與了(-)DOX在大鼠左心房的正性肌力作用。但是，心肌α受體、M膽堿受體、β受體、Ca2+通道、環(huán)氧合酶、cGMP及PKA，可能未參與(+)DOX對大鼠左心房的負性肌力作用。
　　 第三部分，多沙唑嗪對映體在大鼠、犬和人血漿中的蛋白結合率研究
　　 血漿蛋白結合在藥物治療中起著重要的作用。藥物與血漿蛋白結合的變化顯著影響其藥代動力學和藥效學。對映體蛋白結合

28、率的不同往往是它們藥代動力學差異的原因之一。對映體蛋白結合的立體選擇性研究是明確其藥理學效應、臨床療效及安全性必不可少的內容。因此，有必要對多沙唑嗪對映體蛋白結合的立體選擇性進行研究。本研究采用平衡透析法利用卵粘蛋白手性色譜柱同時測定大鼠、犬和人血漿中多沙唑嗪對映體的濃度，并計算其蛋白結合率。
　　 1、高效液相色譜法的方法學驗證
　　 采用高效液相色譜法手性分離血漿及PBS中的（±）DOX，專屬性良好，內標（哌唑嗪）、

29、(-)DOX和(+)DOX達到基線分離，最低檢測限為0.2ng·mL-1(S/N≥3)。多沙唑嗪對映體在血漿、PBS中的濃度范圍分別是50～1600ng·mL-1、12.5～200ng·mL-1，在上述濃度范圍內，多沙唑嗪對映體的濃度與峰面積呈良好的線性關系(r＞0.9990)。多沙唑嗪對映體在血漿和PBS的日內、日間精密度分別小于3.2％、6.3％，回收率為90.5％～102.4％，實驗過程中穩(wěn)定性良好。
　　 2、平衡透析條

30、件的優(yōu)化
　　 在PBS中加入800ng·mL-1的消旋多沙唑嗪，與混合人血漿進行平衡透析，分別在0、4、8、15及20h取樣分析。試驗表明，37℃時，(-)DOX和(+)DOX迅速通過半透膜，在15h內達到穩(wěn)態(tài)水平。犬與大鼠的血漿平衡時間與人血漿相近。
　　 3、不同對映體間蛋白結合的差異
　　 消旋多沙唑嗪的濃度在200～800ng·mL-1時，(-)DOX在三個不同種屬血漿中的蛋白結合率為89.4％～94.

31、3％，(+)DOX為90.9％～95.4％。結果顯示，無論(-)DOX還是(+)DOX的血漿蛋白結合率均較高，與之前（±）DOX的研究結果一致。在三種血漿中，加入不同濃度的消旋多沙唑嗪，(-)DOX的結合濃度(Cb)均大于(+)DOX的Cb（P＜0.05），并且這種差異隨多沙唑嗪濃度的增加而變得更加明顯。這種立體選擇性在犬血漿中比在人或鼠血漿中更為明顯。犬血漿在含200、400、800ng·mL-1(±)DOX的PBS中，(-)DOX與

32、(+)DOX的Cb均值分別為200.0vs243.0、398.6vs477.3、845.1vs1006.8。因此，在人、犬、鼠的血漿中多沙唑嗪對映體的蛋白結合力均體現(xiàn)了立體選擇性，(+)DOX的蛋白結合力均高于(-)DOX。
　　 兩對映體蛋白結合能力的不同可能會導致其藥物代謝動力學的差異，藥物的清除與其在血漿中的游離濃度有直接的關系。(+)DOX的蛋白結合力高于(-)DOX，因此應用消旋多沙唑嗪后人血漿中(-)DOX的非結合態(tài)

33、濃度高于(+)DOX，可能是文獻報道的人服用（±）DOX后血漿中(-)DOX濃度低于(+)DOX濃度的原因之一。事實上，我們將（±）DOX分別給予犬和鼠后，(-)DOX的濃度也低于(+)DOX的濃度。因此，(-)DOX和(+)DOX間血漿蛋白結合能力的不同可能是人、犬、鼠三個種屬中二者藥代動力學不同的原因之一。
　　 4、多沙唑嗪蛋白結合率的種屬差異
　　 加入200ng·mL-1(±)DOX時，三個種屬蛋白結合率差別無

34、統(tǒng)計學意義。而在加入（±）DOX的濃度為400和800ng·mL-1時，犬血漿蛋白結合率小于人的血漿蛋白結合率(P＜0.05和P＜0.01)，此結果與以往報道的人血漿蛋白結合率高于犬一致。由于人、犬、鼠三種混和血漿的血漿蛋白濃度不同（分別為61.81、51.35和57.75mg·mL-1），所以血漿蛋白結合率的值應該用血漿蛋白的濃度進行校正。校正后，多沙唑嗪對映體的蛋白結合率存在種屬差異，其順序為犬＞人＞鼠(P＜0.01)。
　　

35、 以上研究結果表明，在人、犬、鼠的血漿中(+)DOX的蛋白結合力均高于(-)DOX;多沙唑嗪對映體的血漿蛋白結合力在三種血漿中均存在立體選擇性;多沙唑嗪對映體的蛋白結合率具有種屬差異，其順序為犬＞人＞鼠。
　　 結論:
　　 DOX對小鼠離體心房的心率和心肌收縮力具有明顯的影響，高濃度尚可誘發(fā)心臟停博反應;DOX的手性結構對其上述活性具有明顯的影響。相反，ALF僅輕度抑制小鼠心率，ALF的手性結構對其心臟效應無明顯影響

36、。長期灌胃給予DOX及其對映體未顯著影響大鼠心衰生物學標志物NT-proBNP及IL-6的血漿濃度;但是，(+)DOX組大鼠的血漿NF-κB水平顯著高于(-)DOX組，提示(+)DOX對機體免疫及炎癥反應有一定的影響。
　　 (-)DOX增強大鼠心房肌收縮力的作用，可能與心肌α受體、M膽堿受體、β受體以及環(huán)氧合酶無關;L型Ca2+通道、細胞內cGMP以及PKA可能在某種程度上參與了(-)DOX在大鼠左心房的正性肌力作用。但是，心