基于DNA酶的心肌缺血再灌注損傷治療新方法初探-中性粒細(xì)胞胞外核酸網(wǎng)的作用.pdf

1、目的:心肌梗死是全球范圍內(nèi)主要致死原因之一，再灌注療法能夠有效挽救缺血心肌，但缺血再灌注（ischemia reperfusion，I/R）損傷誘導(dǎo)的心肌頓抑、再灌注心律失常、微血管功能失調(diào)以及無(wú)復(fù)流現(xiàn)象(no-reflow, NR)的出現(xiàn)明顯削弱了再灌注療法的心肌獲益。中性粒細(xì)胞胞外核酸網(wǎng)(neutrophil extracellular traps，NETs)是中性粒細(xì)胞在病原體或細(xì)胞因子等刺激下，借助于活性氧類(lèi)物質(zhì)的輔助，釋放的由

2、核染色質(zhì)、組蛋白以及胞內(nèi)抗菌蛋白混合而成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。研究顯示，NETs可通過(guò)其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)捕獲并殺滅入侵的微生物，是中性粒細(xì)胞抵抗病原體入侵、限制其體內(nèi)播散的新途徑。新近研究顯示在無(wú)菌性炎癥中NETs的產(chǎn)生與血栓形成密切相關(guān)。本研究利用缺血再灌注損傷誘導(dǎo)解剖無(wú)復(fù)流的動(dòng)物模型，探討NETs是否存在于大鼠的缺血再灌注心肌，并且觀察清除NETs及NETs相關(guān)血栓是否能夠提高缺血再灌注后的心臟復(fù)流、挽救缺血心肌并且最終改善心肌缺血引起的心室重塑。<

3、br>　　 方法:6周齡雄性Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分組。根據(jù)干預(yù)藥物脫氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease(I)，DNase)和重組組織型纖溶酶原激活劑(recombinant tissue plasminogen activator, rt-PA)使用方式的不同分為I/R Control組（注射生理鹽水）、DNase組（注射DNase）、rt-PA組（注射rt-PA）、DNase+rt-PA組（注射DNa

4、se和rt-PA）、Sham Control組（注射生理鹽水）。各組大鼠開(kāi)胸結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支（Sham組只穿線不結(jié)扎血管）45 min后再灌注3h。于再灌注開(kāi)始前5 min靜脈注射干預(yù)藥物。通過(guò)組蛋白2B(histone2B, H2B)、髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)以及脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)的三色免疫熒光激光共聚焦顯微成像檢測(cè)心肌組織是否存在NETs。通過(guò)氯化三苯

5、基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride，TTC)和伊文斯藍(lán)(Evans blue)雙重染色評(píng)估干預(yù)藥物對(duì)于大鼠心肌梗死面積的影響。通過(guò)硫磺素S和伊文斯藍(lán)雙重染色評(píng)估干預(yù)藥物對(duì)于大鼠心肌無(wú)復(fù)流面積的影響。長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)在保留短期實(shí)驗(yàn)手術(shù)組的基礎(chǔ)上，將假手術(shù)組增加為Sham Control組、Sham DNase組、Sham rt-PA組、Sham DNase+rt-PA組四組。各組大鼠開(kāi)胸結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支（Sh

6、am組只穿線不結(jié)扎血管）45 min后再灌注。于再灌注開(kāi)始前5 min靜脈注射干預(yù)藥物。術(shù)后45天時(shí)應(yīng)用無(wú)創(chuàng)心臟二維超聲檢查和有創(chuàng)血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)評(píng)估大鼠心臟功能及血流動(dòng)力學(xué)改變情況。心臟取材后利用馬松三色染色(Masson trichrome staining)分析左室梗死區(qū)游離壁厚度(left ventricular free wallthickness，LVWT)、室間隔厚度(septum thickness，SPT)，并計(jì)算心臟膨

7、展指數(shù)(index of expansion，IE)。應(yīng)用麥胚凝集素（wheat germ agglutinin，WGA）染色分析心肌細(xì)胞橫斷面積(myocardial cross-sectional area，MCSA)。
　　 結(jié)果:在缺血45 min再灌注3h的大鼠心肌內(nèi)存在H2B、MPO以及DNA三種物質(zhì)的相互融合共表達(dá)，且無(wú)完整的細(xì)胞形態(tài)，提示NETs存在于缺血心肌組織中。
　　 短期實(shí)驗(yàn)評(píng)估心肌梗死面積和解剖

8、無(wú)復(fù)流面積，結(jié)果顯示:各手術(shù)組缺血范圍一致。與I/R Control組相比，DNase+rt-PA組大鼠心梗面積比例(infarctarea/area at risk，IA/AAR)明顯降低(P＜0.001)，同時(shí)該組大鼠無(wú)復(fù)流面積比例(no reflow area/area at risk，NR/AAR)明顯降低（P=0.033）。
　　 長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)評(píng)估心臟結(jié)構(gòu)和功能，結(jié)果顯示:與I/R Control組相比，DNase+rt-

9、PA組大鼠心臟射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction，EF)和短軸縮短率(fractionalshortening，F(xiàn)S)明顯升高(P=0.024，P＜0.001)，收縮期和舒張期左室內(nèi)徑(LVinternal diameter at end-systole/LV internal diameter at end-diastole, LVIDs/LVIDd)明顯降低(P＜0.001，P＜0.001)，左室收縮末期容積和舒張末期容積

10、(end-systolicvolume/end-diastolic volume，ESV/EDV)明顯降低（P=0.002，P=0.002）。血流動(dòng)力學(xué)結(jié)果統(tǒng)計(jì)顯示，DNase+rt-PA組大鼠左心室壓力最大上升速度(maximalslope of systolic pressure increment，+dP/dtmax)和最大下降速度(maximal slope ofdiastolic pressure increment，-dP/

11、dtmin)較I/R Control組明顯升高(P=0.036，P=0.015)，左室舒張末期壓力（left ventricular end diastolic pressure，LVEDP）明顯降低(P=0.019)，左室收縮末期壓力(left ventricular end systolic pressure，LVSP)存在升高趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.078)。病理學(xué)染色檢測(cè)心室重塑顯示，與I/R Control組相比，DNa