抗菌藥物對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌粘附Hela細(xì)胞能力的影響.pdf

1、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)是人類主要的致病菌之一，通常在社區(qū)正常人體內(nèi)也有定居，在住院病人則常常引起嚴(yán)重的感染。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin Resistance Staphylococcus aureus，MRSA)，單從命名來看，會(huì)給人以誤導(dǎo)，因?yàn)榧籽跷髁帜壳耙呀?jīng)不再用于金葡菌的臨床治療，其意義等同于多重耐藥的金黃色葡萄球菌。而隨著由MRSA引起的感染逐漸增多，治療起來也變

2、得越來越困難。粘附是指細(xì)菌通過其表面結(jié)構(gòu)或大分子物質(zhì)定居在細(xì)胞、人工材料等各種固體物質(zhì)表面的過程或能力。近年來，大量研究結(jié)果證明， 粘附是很多細(xì)菌致病的先決條件，是細(xì)菌與宿主相互作用的第一步，病原菌粘附于易感細(xì)胞、粘膜等之上后方能發(fā)揮其正常生理作用，從而引起感染致病。粘附是細(xì)菌致病的第一步，對(duì)細(xì)胞以及基質(zhì)的粘附促進(jìn)細(xì)菌定植以及感染，對(duì)生物材料的粘附促進(jìn)細(xì)菌生物膜的形成。細(xì)菌粘附是個(gè)復(fù)雜的過程，眾多機(jī)制參與其中，涉及了從單體蛋白質(zhì)

3、到極為復(fù)雜的大分子蛋白質(zhì)，不同細(xì)菌的粘附機(jī)制不盡相同。粘附起始靠的是布朗運(yùn)動(dòng)、范德華力、靜電吸引力等物理力作用，不穩(wěn)定、可逆的附于表面，液體的沖擊等即可使其移動(dòng)、脫落。此過程非特異性，連接較松且易于分離；其后，細(xì)菌通過表面的菌毛、鞭毛等細(xì)胞器以及的特定粘附素蛋白(adhesin)與宿主細(xì)胞上的相應(yīng)受體進(jìn)行識(shí)別并相互作用，使其緊緊地附著于宿主細(xì)胞之上并進(jìn)一步發(fā)揮其生理功能，該過程為具有選擇性和特異性，粘附后穩(wěn)定不易分離。產(chǎn)生較為牢固的受體

4、一配體樣特異性結(jié)合，此為粘附的主要過程。粘附成功以后，方開始其進(jìn)一步損傷作用。所以，粘附力大小與致病力強(qiáng)弱直接相關(guān)。對(duì)金黃色葡萄球菌來說，介導(dǎo)粘附的主要為菌體表面的蛋白成分。包括纖維連結(jié)蛋白結(jié)合蛋白(FnBP)、膠原粘附素(CNA)、凝集因子(ClfA)、胞外基質(zhì)結(jié)合蛋白(Emp)等。能夠與宿主細(xì)胞、基質(zhì)成分中的相應(yīng)受體結(jié)合，促進(jìn)細(xì)菌定植、長(zhǎng)期存在。因此，作為MRSA的重要毒力因子之一，粘附力在其致病過程中占據(jù)重要地位，從1981年以后

5、，人們逐漸注意到了在抗菌藥物使用后細(xì)菌粘附能力發(fā)生的變化，并作了一系列研究，已有的研究結(jié)果表明，亞抑菌濃度的抗菌藥物能夠改變MRSA的粘附力，從而增強(qiáng)或減弱其致病力。對(duì)MRSA在抗菌藥物作用下粘附力改變的研究，將進(jìn)一步揭示院內(nèi)MRSA感染的機(jī)制，為控制院內(nèi)MRSA感染提供新的策略，同樣也有助于研發(fā)新的抗感染生物材料。 材料和方法: 1、實(shí)驗(yàn)菌株的準(zhǔn)備 通過纖維支氣管鏡吸取呼吸內(nèi)科ICU內(nèi)MRSA肺炎患者下呼吸道分

6、泌物，經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)及分離，利用傳統(tǒng)生化鑒定結(jié)合藥敏結(jié)果確定為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌。 2、抗菌藥物對(duì)MRSA的誘導(dǎo) 準(zhǔn)備5種臨床常用抗菌藥物，分別為頭孢他啶、亞胺培南、環(huán)丙沙星、萬古霉素、阿奇霉素。根據(jù)美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)抗菌藥物敏感性試驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)，以液體對(duì)倍稀釋法測(cè)其分別對(duì)應(yīng)于5種抗菌藥物的MIC,測(cè)定時(shí)以標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC 29213)作為參照，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。繼而配制含有1/4MIC、1/16

7、MIC抗菌藥物的MH肉湯，加入菌液使其細(xì)菌濃度約為5×10<'5>CFU，37℃ 5﹪CO<,2>下孵育20小時(shí)，5000rpm,5min離心收集細(xì)菌，PBS洗滌2次，加入PBS使其重新懸浮并調(diào)整濃度至約1×10<'8>CFU/ml(OD=0.2，625nm)； 3、上皮細(xì)胞的培養(yǎng) 將人宮頸癌上皮細(xì)胞株(Hela細(xì)胞)轉(zhuǎn)至50cm<'2>培養(yǎng)瓶，加3ml含10﹪胎牛血清、2﹪HEPES的RPMl 1640完全培養(yǎng)液，放入

8、37℃，95﹪濕度，5﹪CO<,2>細(xì)胞培養(yǎng)箱，2～4天更換一次新鮮培養(yǎng)液，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至培養(yǎng)瓶面積的80～90﹪傳代，約5～7天傳代一次。取用細(xì)胞時(shí)，吸出培養(yǎng)液，以D-HANKS液洗滌2次，加入胰蛋白酶-EDTA消化液，倒置顯微鏡下實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞消化情況，若胞質(zhì)回縮，細(xì)胞之間不再連接成片，表明細(xì)胞消化適度。棄去胰蛋白酶液，加入新鮮的培養(yǎng)液。用滴管將已經(jīng)消化細(xì)胞吹打成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液吸入15ml離心管中。以1000rpm，8min離

9、心。棄上清液，加入2ml培養(yǎng)液，用滴管輕輕吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。吹打均勻后，以血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，并調(diào)整細(xì)胞濃度為3×10<'5>/mL備用； 4、粘附實(shí)驗(yàn) 4.1非特異性粘附實(shí)驗(yàn)將細(xì)菌懸液濃度調(diào)整至10<'5>CFU/L，取菌液約0.2ml，均勻涂于玻片約1.0×1.0 cm<'2>區(qū)域內(nèi)，放入培養(yǎng)箱，37℃，5﹪CO<,2>4小時(shí)；繼而以無菌水漂洗玻片，去除未粘附的細(xì)菌，酒精燈干燥、固定殘留細(xì)菌，瑞氏法染色，置光學(xué)

10、顯微鏡下觀察每高倍視野(×1000)殘留細(xì)菌數(shù)量，每張玻片計(jì)數(shù)12個(gè)視野； 4.2特異性粘附能力 (1)以酶消化法制備Hela細(xì)胞懸液，并調(diào)整細(xì)胞濃度至3×10<'5>/ml； (2)將經(jīng)過抗菌藥物誘導(dǎo)的含菌肉湯離心，收集細(xì)菌，以PBS洗滌1次，再次加入PBS使其重新懸浮，根據(jù)比濁法及分光光度儀調(diào)整細(xì)菌濃度至約為1×10<'8>CFU/ml； (3)將制備好的細(xì)菌及細(xì)胞懸液按照1：1混合，置于37℃，5﹪CO<,2>培養(yǎng)箱中1小

11、時(shí)后取出，1000rpm，5min離心收集細(xì)胞，并以PBS洗滌3次，以去除未粘附之細(xì)菌，盡可能倒盡上清液，再次加入PBS液40榪重新懸浮細(xì)胞，并于蓋玻片上涂片，自然干燥后行瑞氏．吉姆薩染色，光學(xué)顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)不同抗菌藥物濃度下生長(zhǎng)的細(xì)菌在細(xì)胞上的粘附比率。 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)表示，應(yīng)用SAS 8.01統(tǒng)計(jì)分析軟件包進(jìn)行進(jìn)行t檢驗(yàn)及方差分析。P值<0.05被認(rèn)為是有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的。

12、結(jié)果: 頭孢他啶、亞胺培南、環(huán)丙沙星能夠增強(qiáng)MRSA的粘附力。萬古霉素、阿奇霉素能夠降低MRSA的粘附力。討論與結(jié)論粘附是細(xì)菌定植、致病的先決條件，與細(xì)菌毒素一起決定了細(xì)菌的致病力。MRSA粘附力的增強(qiáng)或減弱是其表面蛋白表達(dá)增加或減少的結(jié)果。這些蛋白包括：纖維連接蛋白結(jié)合蛋白(Fnbp)、膠原粘附素(CNA)、凝集因子(CIfA)等。粘附的主要過程就是細(xì)菌表面的粘附分子與宿主細(xì)胞或細(xì)胞外基質(zhì)上的受體相互識(shí)別、結(jié)合的過程，抗菌藥物

13、在轉(zhuǎn)錄、翻譯等不同水平作用于這一過程而影響MRSA的粘附力。由于存在結(jié)構(gòu)上的差異，不同類的抗菌藥物影響機(jī)制則不盡相同。本試驗(yàn)結(jié)果提示：頭孢他啶、亞胺培南、環(huán)丙沙星等抗菌藥物顯示出能夠增加MRSA粘附力，而阿奇霉素、萬古霉素則起抑制粘附作用。目前，在臨床上，頭孢他啶、亞胺培南等β-內(nèi)酰胺類廣譜抗菌藥物的使用日益廣泛，而MRSA由于多重耐藥，在體內(nèi)，這些藥物難以達(dá)到有效抑菌、殺菌濃度，因此不能夠清除定居于上呼吸道MRSA，而頭孢他啶、亞胺培

14、南的使用反而使其粘附力增加，易于在下呼吸道定植并進(jìn)一步致病。這與我們臨床觀察結(jié)果相一致。β-內(nèi)酰胺類廣譜抗菌藥物的廣泛使用有可能是造成院內(nèi)MRSA感染率增加的原因之一。環(huán)丙沙星的使用同樣能夠增強(qiáng)MRSA的粘附力，進(jìn)而增加院內(nèi)MRSA肺炎的機(jī)會(huì)。經(jīng)過環(huán)丙沙星誘導(dǎo)后的MRSA，F(xiàn)nbpB的表達(dá)增加是其粘附力增強(qiáng)的原因。不同的臨床統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，環(huán)丙沙星的使用容易導(dǎo)致院內(nèi)MRSA肺炎的發(fā)生。 萬古霉素能夠降低MRSA粘附力的作用，從而降

15、低致病力。然而，盡管萬古霉素表現(xiàn)出有效的抗MRSA活性(MIC=1.0mg/L)，甚至在抑菌濃度以下也能夠減弱其致病力，但為了減少耐藥的發(fā)生，應(yīng)盡可能減少萬古霉素的使用，以維持其目前尚有效的抗MRSA活性。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示亞抑菌濃度的阿奇霉素能夠減弱MRSA的粘附力，另有許多研究結(jié)果提示此類藥物包括紅霉素等能夠明顯減少M(fèi)RSA外毒素的表達(dá)，抗菌機(jī)制與其相同的紅霉素、克林霉素也可能具有同樣作用。在MRSA所致的感染中，外毒素起著重要作用，

16、因此臨床上在治療MRSA感染時(shí)，若中毒癥狀較重，可考慮使用阿奇霉素、克林霉素等藥物以拮抗毒素作用，也許在今后，抗毒素治療有可能成為MRSA感染的重要治療措施。 本試驗(yàn)揭示了各類抗菌藥物對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌粘附能力的不同影響，結(jié)果提示：頭孢他啶、亞胺培南等β-內(nèi)酰胺類藥物能夠增加MRSA的粘附能力，進(jìn)而增強(qiáng)其致病力，因此，它們的廣泛使用在一定程度上增加了MRSA感染的機(jī)會(huì)，可能是引起院內(nèi)MRSA肺炎的重要原因。而環(huán)丙沙星的使

17、用同樣顯示出增強(qiáng)粘附力的作用，也能夠增加院內(nèi)MRSA感染的發(fā)生機(jī)會(huì)。萬古霉素及阿奇霉素，則對(duì)MRSA粘附力存在抑制作用：萬古霉素的使用將不可避免增加耐藥性產(chǎn)生的機(jī)會(huì)；阿奇霉素除了能夠抑制MRSA的粘附力以外，還有可能減少其外毒素的產(chǎn)生，與其作用機(jī)制相同的紅霉素、克林霉素亦可能具有相似的作用。這對(duì)于臨床工作者在抗菌藥物的選用方面提供參考意義。合理的使用抗菌藥物，有助于控制院內(nèi)MRSA感染率，減少耐藥菌株的產(chǎn)生，達(dá)到最佳的治療效果。