胃癌血清適配子對(duì)胃癌診斷價(jià)值的研究.pdf

1、背景與目的:
　　目前胃癌的篩查性診斷主要依賴胃鏡,但是胃鏡為有創(chuàng)性檢查,且費(fèi)用較高,部分患者因恐懼而不愿接受胃鏡檢查。血清腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)是簡(jiǎn)便易行的腫瘤篩查診斷方法,但目前仍缺乏有臨床價(jià)值的胃癌標(biāo)志物。適配子是一種生物分子的單鏈核酸配體,通過(guò)指數(shù)擴(kuò)增的配體系統(tǒng)進(jìn)化(SELEX)技術(shù)從人工合成的單鏈隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)中篩選獲得,能高特異性、高親和力結(jié)合靶分子,用于疾病診斷具有良好的應(yīng)用前景。本課題組在前期研究中,以胃癌血清為靶標(biāo)進(jìn)行

2、了10輪適配子篩選,克隆分離出一批適配子,其中部分適配子與胃癌混合血清的結(jié)合程度大于與正?；旌涎?但對(duì)胃癌診斷價(jià)值并不理想。為此,本研究在前期篩選的基礎(chǔ)上繼續(xù)篩選特異性更好的適配子,然后進(jìn)行基于適配子的胃癌診斷研究,為建立新的胃癌篩查性診斷新技術(shù)奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.血清標(biāo)本收集及混合血清的制備:收集南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院2012-2013年間就診的胃癌、非萎縮性胃炎、消化性潰瘍病人和參加體檢且各項(xiàng)檢查均正常的健康

3、人的血清標(biāo)本,-80℃保存?zhèn)溆?。隨機(jī)取胃癌血清標(biāo)本15例等量混合制備胃癌混合血清,同法制備正?；旌涎?。
　　2.胃癌血清適配子的再篩選和分離:以前期第10輪胃癌血清適配子篩選后的亞文庫(kù)繼續(xù)進(jìn)行SELEX篩選,并采用聚丙烯酰胺電泳逐輪監(jiān)測(cè)亞文庫(kù)條帶的集中度和特異性,并據(jù)此確定篩選終點(diǎn)。選擇與胃癌混合血清有特異性結(jié)合的適配子亞文庫(kù)進(jìn)行對(duì)稱PCR擴(kuò)增,送生物工程公司克隆測(cè)序,分離適配子。
　　3.胃癌血清適配子的鑒定:采用RNA

4、Structure4.6軟件模擬分析所分離適配子的二級(jí)結(jié)構(gòu)。選出二級(jí)結(jié)構(gòu)少且自由能低的適配子進(jìn)行人工合成,采用聚丙烯酰胺凝膠電泳及灰度分析法先確定適配子與血清標(biāo)本作用時(shí)兩者的合適用量,再小樣本血清標(biāo)本鑒定適配子與胃癌血清結(jié)合的特異性,即將適配子分別與胃癌和正常血清標(biāo)本各16例孵育、聚丙烯酰胺凝膠電泳和GelRed染色,測(cè)定游離帶的灰度值,計(jì)算其與適配子對(duì)照的比值。胃癌組灰度比值小于正常組且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義者為胃癌血清特異性適配子。

5、>　　4.熒光法評(píng)價(jià)適配子對(duì)胃癌的診斷價(jià)值:選出對(duì)胃癌血清有一定特異性的適配子,采用本課題組建立的熒光法來(lái)評(píng)價(jià)它們對(duì)胃癌的診斷價(jià)值。在確定適配子及血清的合適用量后,隨機(jī)挑選胃癌、正常血清標(biāo)本各15例,初步篩選對(duì)胃癌有診斷價(jià)值適配子。選擇組間有差異且診斷胃癌的AUROC在0.9以上的適配子,熒光法小樣本(胃癌、正常血清標(biāo)本各32例)驗(yàn)證它們對(duì)胃癌的診斷價(jià)值。對(duì)小樣本驗(yàn)證有價(jià)值的適配子再擴(kuò)大樣本(胃癌、良性胃病、正常血清各100例左右)確認(rèn)

6、它們對(duì)胃癌的診斷價(jià)值。同時(shí)以結(jié)合緩沖液代替適配子測(cè)定血清標(biāo)本的本底熒光值。單獨(dú)和聯(lián)合分析適配子、血清本底熒光值診斷胃癌的AUROC和效能(敏感度、特異度、準(zhǔn)確度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、陽(yáng)性似然比和陰性似然比)。
　　結(jié)果:
　　1.胃癌血清適配子的再篩選和分離:再篩選過(guò)程中,電泳顯示亞文庫(kù)條帶逐漸集中,與胃癌混合血清結(jié)合的特異性呈不斷增強(qiáng)趨勢(shì),至第18輪時(shí)停止篩選。取第14~18輪的亞文庫(kù)分別送公司克隆,共分離出160個(gè)適

7、配子。
　　2.胃癌血清適配子的鑒定:二級(jí)結(jié)構(gòu)模擬分析顯示所分離的適配子有豐富的二級(jí)結(jié)構(gòu),其中21個(gè)適配子的二級(jí)結(jié)構(gòu)多樣性少于2種。小樣本血清標(biāo)本鑒定顯示,21個(gè)適配子中有11個(gè)的胃癌組游離條帶灰度比值小于正常組,且組間差異有或接近有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.1),即胃癌血清特異性適配子。
　　3.適配子對(duì)胃癌的診斷價(jià)值:將上述11個(gè)胃癌血清特異性適配子分別與胃癌、正常血清標(biāo)本各15例孵育后測(cè)定熒光值,結(jié)果顯示有3個(gè)適配子(AP-

8、GCS-15-16、AP-GCS-16-17、AP-GCS-17-16)診斷胃癌的AUROC達(dá)到0.9以上。將這3個(gè)初篩對(duì)胃癌有良好診斷價(jià)值的適配子進(jìn)行小樣本驗(yàn)證(胃癌、正常血清各32例),結(jié)果顯示適配子AP-GCS-15-16、AP-GCS-17-16診斷胃癌的AUROC均在0.7以上。對(duì)這2個(gè)適配子擴(kuò)大樣本(胃癌106例、良性胃病84例、正常血清94例)驗(yàn)證它們對(duì)胃癌的診斷價(jià)值,結(jié)果顯示適配子 AP-GCS-15-16的熒光值在胃癌

9、組與良性胃病組和正常組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001),而良性胃病組與正常組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),診斷胃癌的AUROC達(dá)到“良好”水平(0.880),敏感度為70.8％,特異度為84.9%,準(zhǔn)確度為79.6%,但AP-GCS-17-16只有0.656。此外,血清本底熒光對(duì)胃癌的診斷價(jià)值有限,AUROC只有0.632。
　　4.適配子聯(lián)合分析對(duì)胃癌的診斷價(jià)值:聯(lián)合分析可提高對(duì)胃癌的診斷價(jià)值。AP-GCS-15-16與血清本

10、底熒光聯(lián)合檢測(cè)診斷胃癌的AUROC從0.880提高至0.920,敏感度為89.6%,特異度為81.5%,確準(zhǔn)度為84.5%;AP-GCS-17-16與血清本底熒光聯(lián)合檢測(cè)診斷胃癌的AUROC從0.656提升至0.725;AP-GCS-15-16與AP-GCS-17-16聯(lián)合分析診斷胃癌的AUROC為0.885,無(wú)明顯提高。
　　結(jié)論:
　　(1)通過(guò) SELEX技術(shù)再篩選,成功獲得一組胃癌血清適配子,其中部分適配子能與胃癌血