先天性魚鱗病患者的指甲和鱗屑的表型改變研究.pdf

1、背景 皮膚的角化過程也是角質(zhì)形成細胞(keratinocyte,KC)分化及凋亡的過程.表皮內(nèi)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶1(transglutomlnase 1,TGase 1)可交聯(lián)細胞膜套(cellenvelope)前體蛋白,主要包含內(nèi)皮蛋白((jmvolucrin)、兜甲蛋白(loricrin),還有絲聚蛋自(maggrin)以及小的富含脯氨酸蛋白(small proline-rich proteins)等的ε-(γ-)谷氨酰一賴氨酸殘

2、基而形成加厚的細胞膜套,這種交聯(lián)十分穩(wěn)定,可以抵抗蛋白酶的水解作用.TGase 1和內(nèi)皮蛋白為細胞膜套分化的標志.此外,TGase1也能交聯(lián)人類內(nèi)皮蛋白的谷氨酰胺殘基和表皮特異的Ω-羥基神經(jīng)酰胺(Ω-hydroxyceramide),在二者之間形成酯鍵,參與脂質(zhì)膜套(lipid envelope)的形成.脂質(zhì)膜套也是表皮行使屏障功能的一個關(guān)鍵組分,主要由鞘磷脂(sphingomyelin)與神經(jīng)酰胺(ceramide)等類脂成分組成.脂

3、質(zhì)膜套和細胞膜套共同形成具有彈性和可通透性的表皮水屏障,它不但可避免機體必需的水分、離子丟失,而且也有助于KC的正常脫屑.因此,TGase 1是形成和維持表皮水屏障的關(guān)鍵酶. 先天性魚鱗病(congenital ichthyosis)是表型相似、以皮膚呈現(xiàn)大面積粘著的灰褐色片狀鱗屑為特征,輕重程度不等的一組疾病.常見的遺傳方式為常染色體隱性遺傳和顯性遺傳.1994年Russell等通過對常染色體隱性遺傳性魚鱗病 (autosom

4、al recessive congenital ichthyosis,ARCI)患者家系的連鎖分析發(fā)現(xiàn)其致病基因為TGase 1,定位于染色體14q11.已有研究表明在ARCI患者中,約有1/3為TGase1基因缺陷所致,被稱為是經(jīng)典的板層狀魚鱗病(lamellar ichthysis,LI)患者.2005年Rice等學(xué)者通過比較觀察ARCI患者與正常人指甲和鱗屑等電鏡下和相差光鏡的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)ARCI患者的細胞膜套結(jié)構(gòu)不完整,可作為TGa

5、se 1酶活性缺陷的指標. 本研究采取魚鱗病患者的指甲和鱗屑,以正常人為對照,應(yīng)用組織化學(xué)方法對鱗屑標本進行膽固醇、不飽和脂肪酸和磷脂染色;以Trizol試劑提取指甲蛋白質(zhì)進行SDS-PAGE:并應(yīng)用免疫組化方法和免疫印跡觀察鱗屑和指甲兩者標本的內(nèi)皮蛋白的表達,進一步分析板層狀魚鱗病患者的基因與表型的關(guān)系,為先天性魚鱗病的臨床治療提供研究基礎(chǔ). 材料和方法 1.取5例板層狀魚鱗病患者、5例尋常魚鱗病患者(均經(jīng)臨床

6、診斷證實)和10例正常人的指甲和鱗屑標本,皆密封干燥低溫保存. 2.將指甲磨碎成粉狀,各稱量50mg置于Eppendorc管內(nèi).以Trizol試劑提取蛋白質(zhì),檢測蛋白質(zhì)濃度后進行SDS-PAGE.另取小部分指甲以脫垢劑提取法處理后制備冰凍切片. 3.將SDS-PAGE中的目的條帶電轉(zhuǎn)膜于硝酸纖維素膜(NCM)上,進行內(nèi)皮蛋白的免疫印跡. 4.對鱗屑鋪片和脫垢劑處理過的指甲的冰凍切片進行內(nèi)皮蛋白的免疫組織化學(xué)染色5

7、.制備鱗屑單層鋪片標本.以10﹪福爾馬林鈣固定后,分別應(yīng)用丙酮-硫酸尼羅蘭法示磷脂、鋨酸示不飽和脂肪酸、過氯酸.萘醌法示膽固醇. 結(jié)果 1.指甲的SDS-PAGE電泳圖顯示在同一蛋白濃度下條帶的深淺雖有個體差異,但在帶型方面正常人呈現(xiàn)4條主帶,分別為63kDa、54kDa、48kDa、38kDa;魚鱗病患者呈現(xiàn)5條主帶,分別是69kDa、63kDa、54kDa、48kDa、38kDa.此外,5例板層狀魚鱗病患者呈現(xiàn)69k

8、Da的OD值高于63kDa的OD值,P<0.05;而5例尋常魚鱗病患者的63kDa的OD值均高于69kDa的OD值P<0.05. 2.指甲的免疫印跡顯示63kDa-158kDa的條帶呈現(xiàn)內(nèi)皮蛋白的免疫反應(yīng)陽性. 3.魚鱗病患者的鱗屑和指甲的標本顯示的內(nèi)皮蛋白免疫組化染色反應(yīng)強度低于正常對照組,P<0.05.4.鱗屑鋪片顯示魚鱗瘸患者角質(zhì)形成細胞的角化膜套均不如正常人的明顯可見;此外,磷脂、膽固醇和不飽和脂肪酸含量皆低于正

9、常對照組,p<0.05. 小結(jié) 1.免疫印跡顯示指甲內(nèi)皮蛋白表達的分子量范圍位于63 kDa-158 kDa條帶. 2.魚鱗病患者不但內(nèi)皮蛋白(角化細胞膜套的主要成分)表達下調(diào):而且脂質(zhì)膜套中類脂含量降低.這提示患者的兩種膜套的分化缺陷和屏障功能不良. 3.魚鱗病患者指甲蛋白的SDS-PAGE電泳圖比正常者多一條主帶.而且板層狀魚鱗病患者個體的69 kDa.63 kDa的OD比值高于尋常魚鱗病患者個體的6