兒童青少年生物學(xué)年齡判定方法研究.pdf

1、無論在醫(yī)學(xué)界、法醫(yī)界以及競技體育領(lǐng)域，都對(duì)人類實(shí)際年齡的準(zhǔn)確判斷有著較大的需求。尤其在競技體育領(lǐng)域，準(zhǔn)確判定運(yùn)動(dòng)員實(shí)際日歷年齡已經(jīng)成為了各國在推進(jìn)體育公平性中面臨的最大挑戰(zhàn)。但是，由于年齡判定研究不僅需要涉及醫(yī)學(xué)不同領(lǐng)域的知識(shí)，甚至需要跨多個(gè)行業(yè)團(tuán)隊(duì)的合作研究，因此盡管這一領(lǐng)域的研究已有較為悠久的歷史，但時(shí)至今日仍是個(gè)有爭議的話題?；诠驱g的推算方法是目前判定實(shí)際年齡最常用的方法之一，但其準(zhǔn)確性受到越來越多的挑戰(zhàn)，尤其在體育競技領(lǐng)域中，

2、運(yùn)動(dòng)類型、年限以及青春發(fā)育等多種因素都會(huì)對(duì)骨齡造成較大的影響，單純依靠骨齡已經(jīng)無法滿足對(duì)年齡準(zhǔn)確判定的需求。因而，尋求更準(zhǔn)確的年齡推斷方法顯得尤為迫切。
　　本研究在對(duì)國內(nèi)外具有代表性的個(gè)體生物學(xué)年齡判定研究方法總結(jié)后，系統(tǒng)地分析了牙齒形態(tài)發(fā)育和基因甲基化水平的增齡性變化在兒童青少年生物學(xué)年齡判定研究中的特點(diǎn)，并進(jìn)一步提取與生物學(xué)年齡密切相關(guān)的各種量化標(biāo)志性指標(biāo)，通過建立相關(guān)的數(shù)學(xué)模型，尋找多種量化指標(biāo)的最佳組合，以期能在現(xiàn)有的水

3、平上，進(jìn)一步提高個(gè)體實(shí)際年齡判定的精確性。本研究分兩個(gè)部分探討。
　　第一部分，基于牙齒形態(tài)學(xué)的生物學(xué)年齡判定方法研究
　　1.研究目的
　　1.1.比較和探索基于牙齒形態(tài)學(xué)的牙齡判定方法。
　　1.2.整合基于牙齒形態(tài)學(xué)的各項(xiàng)量化指標(biāo)，探尋年齡預(yù)測模型，以期準(zhǔn)確推斷實(shí)際年齡。
　　2.研究方法和內(nèi)容
　　本研究屬于橫斷面研究，共納入952份7～14歲正常樣本的口腔曲面斷層全景片，其中男孩414人(4

4、3.6％)，平均年齡為12.14歲(SD1.81)。首先，依據(jù)Demirjian牙齒發(fā)育階段圖譜，驗(yàn)證漢族兒童青少年左、右下頜牙齒發(fā)育的一致性;進(jìn)而根據(jù)相應(yīng)的牙齡換算方法，分別獲得左下頜7顆恒牙Demirjian法牙齡(M2 M1 PM2 PM1 C I2 I1，簡稱D7)、4顆恒牙Demirjian法Ⅰ(M2 M1 PM2 PM1，簡稱D4Ⅰ)、4顆恒牙Demirjian法Ⅱ(M2 PM2 PM1 I1，簡稱D4Ⅱ)和Willems法

5、(M2 M1 PM2 PM1 C I2 I1，簡稱W，為D7法的修正版本)四種牙齡判定值。再次，根據(jù)牙齒相關(guān)長度和寬度的改變，測量左下頜各恒牙的牙齒、牙髓和牙根的長度，牙根尖、牙體的寬度等，獲得Cameriere法相關(guān)變量（包括No，S，X1～X7和Xi）和改良Kvall法相關(guān)變量（包括單根牙I2、C和PM2的P、T和R等），并驗(yàn)證Cameriere法（歐洲模型）在漢族人群中的應(yīng)用。最后，采用多元線性回歸分析，結(jié)合以上基于牙齒發(fā)育圖譜的

6、4種牙齡判定方法結(jié)果和測量法中的相關(guān)測量指標(biāo)分別進(jìn)行年齡預(yù)測模型探索。
　　3.研究結(jié)果
　　3.1.左、右下頜恒牙發(fā)育基本是一致的，依據(jù)Demirjian牙齒發(fā)育階段圖譜，兩側(cè)下頜牙齒發(fā)育階段的一致率在93％以上，Kappa值0.9以上。說明基于左下頜的恒牙相關(guān)測量指標(biāo)可以代表整體下頜恒牙發(fā)育水平。但牙齒的發(fā)育有顯著性別差異，提示在進(jìn)行牙齡判斷時(shí)應(yīng)考慮性別因素。
　　3.2.各種牙齡判定方法研究
　　3.2.1

7、.左下頜7顆恒牙Demirjian法和Willems法牙齡判定研究
　　該方法包括Demirjian法(D7)和Willems法。與實(shí)際年齡相比，除女孩Willems法牙齡外，男孩Willems法和Demirjian法牙齡對(duì)實(shí)際年齡均有高估(P＜0.001)，以Demirjian法更加明顯。其中，Demirjian法(D7)與實(shí)際年齡的差值為1.45年(SD1.24)(P＜0.001)，男孩為1.68年(SD1.29)，女孩為1.

8、28年(SD1.17);Willems與實(shí)際年齡的差值為0.16年(SD1.20)(P＜0.001)，男孩為0.36年(SD1.19)(P＜0.001)，女孩為0.02年(SD1.18)(P＞0.05)。
　　3.2.2.左下頜4顆恒牙Demirjian法牙齡判定方法研究
　　Demirjian4Ⅰ法和Demirjian4Ⅱ法的預(yù)測牙齡對(duì)實(shí)際年齡均存在高估現(xiàn)象(P＜0.01)。男孩Demirjian4Ⅰ法牙齡與實(shí)際年齡差值為

9、0.88年(SD1.46);女孩為0.21年(SD1.39);男孩Demirjian4Ⅱ法牙齡與實(shí)際年齡的差值為1.24年（SD1.22年），女孩為0.53年（SD1.21年）。
　　3.2.3.Cameriere法牙齡研究
　　根據(jù)Cameriere法年齡預(yù)測模型（歐洲模型），Age=8.387+0.282*sex-1.692*X5+0.835*No-0.116*S-0.139*SxNo，我們得到如下結(jié)果:實(shí)際年齡為12.

10、15歲(SD1.81)，Cameriere法牙齡為9.70歲(SD2.32)，估計(jì)年齡與實(shí)際年齡的差值為-2.49年(SD1.70)。其中，男孩的實(shí)際年齡為11.94歲(SD1.90)，Cameriere法牙齡為9.73歲(SD2.34)，比實(shí)際年齡低估2.45年(SD1.75);女孩的實(shí)際年齡為12.32歲(SD1.71)，估計(jì)牙齡為9.69歲(SD2.31)，比實(shí)際年齡低估2.52年(SD1.66)。無論男孩還是女孩，平均預(yù)測誤差均

11、大于2.5年以上。說明該預(yù)測方程并不合適中國兒童青少年人群。
　　3.3.各種判定方法的比較
　　Demirjian法（D7、D4Ⅰ和D4Ⅱ）、Willems法和Cameriere法等五種年齡判定方法中，以Willems法最準(zhǔn)確，與實(shí)際年齡的差值為0.16年(SD1.19)，估計(jì)誤差為0.95年，有59.7％的牙齡值與實(shí)際年齡的差異在1歲以內(nèi)。Demirjian法(D7)對(duì)年齡的高估現(xiàn)象最明顯，與年齡的差值為1.45年(SD

12、1.24)，67.5％的Demirjian法(D7)牙齡比實(shí)際年齡高估1歲以上。最不準(zhǔn)確的是Cameriere法，79.6％的Cameriere法牙齡比實(shí)際年齡低估1歲以上，與實(shí)際年齡的差值為-2.49年(SD1.70)，預(yù)測誤差為2.64年。
　　3.4.年齡預(yù)測模型探索
　　我們?cè)诜治鏊姆N牙齡判定法的基礎(chǔ)上，增加了其他牙齡測量指標(biāo)（包括Cameriere法和改良的Kvall法），對(duì)年齡進(jìn)行預(yù)測，得到如下最佳預(yù)測方程:

13、r>　　Age=9.738+0.284*W-0.019*S*No-3.737*X5-3.746*X3-0.293*RPM2（男孩）
　　Age=6.705+0.38* W-7.053*X4-0.052*S*No+2.863*RC（女孩）
　　進(jìn)入男孩年齡預(yù)測方程有5個(gè)變量，女孩的預(yù)測方程有4個(gè)變量，Willems法牙齡對(duì)方程的貢獻(xiàn)均最大。男孩的年齡預(yù)測方程能解釋82.1％的變異，其判定年齡與實(shí)際年齡的差值為-0.03年(SD

14、0.70)，MAE為0.56年;女孩的年齡預(yù)測方程能解釋73.5％的變異，判定年齡與實(shí)際年齡的差值為-0.004年(SD0.84)，MAE為0.65年。
　　我們同時(shí)對(duì)104例含有身高和體重變量的人群數(shù)據(jù)進(jìn)行模型探索，獲得如下預(yù)測方程:
　　Age=-5.799+0.242*W+0.096*Height-2.83*X4(boy)
　　Age=-1.267+0.229*W+0.080*Height+6.561*X6-0.

15、976*X7-0.301*S(girl)
　　該兩個(gè)方程的預(yù)測效力得到了明顯的提高，男孩的年齡預(yù)測方程能解釋89.3％的變異，判定年齡與實(shí)際年齡的差值為-0.07年(SD0.54)，MAE為0.43年;女孩的年齡預(yù)測方程能解釋88.0％的變異，女孩高估0.07年(SD0.67)，MAE為0.56年。但目前該方程使用的樣本量少，此處只做探索，建議進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量后再確定。
　　3.5.骨齡、牙齡與年齡的關(guān)系探討
　　我們

16、對(duì)收集到的13例樣本進(jìn)行了牙齡、骨齡和年齡關(guān)系的初步探討。左下頜各恒牙中以尖牙、第一前磨牙、第二前磨牙和第二磨牙的發(fā)育階段與骨齡和年齡的相關(guān)性最好(P＜0.05)，相關(guān)性最差的是中切牙。
　　骨齡、牙齡和兩者的平均值均與實(shí)際年齡有著較好的相關(guān)性(P＜0.01)，以Willems法相關(guān)性最強(qiáng)(r=0.85，P＜0.01);其次是骨齡和Willems法牙齡的平均值(r=0.79，P＜0.01);骨齡與年齡的相關(guān)系數(shù)為0.72(P＜0.

17、05)。與實(shí)際年齡的差值，骨齡為0.71年(SD1.74)，P＞0.05; Willems法為1.28年(SD1.40)，P＜0.05;差異最大是Demirjian法(D7)為2.42年(SD1.68)， P＜0.05。
　　4.結(jié)論
　　4.1.漢族兒童青少年左、右下頜恒牙發(fā)育基本是一致的，基于左下頜的恒牙相關(guān)指標(biāo)可以代表整體下頜恒牙發(fā)育水平。牙齒發(fā)育有性別差異，提示在進(jìn)行牙齡判斷時(shí)應(yīng)考慮性別因素。
　　4.2.根據(jù)

18、牙齒發(fā)育形態(tài)的增齡性變化來推斷個(gè)體生物學(xué)的年齡是可行的。以Willems法的準(zhǔn)確性最高，但建議使用時(shí)需進(jìn)一步修正。準(zhǔn)確性最差是Cameriere法（歐洲模型）。Cameriere法（歐洲模型）不適合應(yīng)用在漢族兒童青少年。
　　4.3.針對(duì)7～14歲個(gè)體，按照下列預(yù)測模型進(jìn)行個(gè)體的年齡判定，可提高準(zhǔn)確性。該兩個(gè)預(yù)測方程在不同性別中的年齡預(yù)測誤差在1歲左右。
　　Age=9.738+0.284*W-0.019*S*No-3.73

19、7*X5-3.746*X3-0.293*RPM2（男孩）
　　Age=6.705+0.38* W-7.053*X4-0.052*S*No+2.863*RC（女孩）
　　4.4.本研究小樣本探索了結(jié)合牙齒全景片和身高、體重變量的預(yù)測模型，該預(yù)測模型的預(yù)測效力得到了明顯的提高，整合多個(gè)生物學(xué)指標(biāo)可能將為進(jìn)一步提高生物學(xué)年齡判定的準(zhǔn)確性研究提供方向。
　　第二部分，DNA甲基化水平與兒童青少年年齡的相關(guān)性研究
　　1.

20、研究目的
　　1.1.利用全基因組甲基化芯片技術(shù)及生物信息學(xué)方法對(duì)正常兒童青少年的末梢指尖血進(jìn)行全基因組甲基化水平研究，篩選年齡相關(guān)的基因甲基化位點(diǎn)。
　　1.2.整合基因甲基化位點(diǎn)和個(gè)體生物學(xué)信息，探索年齡預(yù)測模型，以期準(zhǔn)確推斷個(gè)體兒童青少年的實(shí)際年齡。
　　2.研究方法
　　2.1.招募68例7～14歲正常兒童青少年，獲得65份合格的末梢指尖血樣本，并獲取包括骨齡、青春期發(fā)育的Tanner分期、身高、體重和出

21、生體重等在內(nèi)的個(gè)體基本信息。
　　2.2.純化和定量基因組DNA，采用人類全基因組甲基化芯片(450K Infinium MethylationBeadChip)，對(duì)全基因組中大于450000的CpG島或CpG位點(diǎn)進(jìn)行甲基化分析。
　　3.結(jié)果
　　3.1.根據(jù)原始數(shù)據(jù)情況，我們篩選了與實(shí)際年齡的相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值大于等于0.5的DNA甲基化位點(diǎn)。共得到44個(gè)甲基化基因位點(diǎn)，其中已知基因31個(gè)，未知基因13個(gè)。已知基因均為

22、蛋白質(zhì)編碼基因，主要分布于基因的內(nèi)部和上下游，參與人體的細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)錄、分化、運(yùn)輸和代謝等多方面功能。
　　3.2.共44個(gè)甲基化位點(diǎn)中，有41個(gè)基因位點(diǎn)的甲基化水平與年齡呈負(fù)相關(guān)，僅有三個(gè)基因位點(diǎn)的甲基化水平與實(shí)際年齡成正相關(guān)。
　　3.3.基于DNA甲基化水平的年齡預(yù)測模型探索
　　根據(jù)探索性分析，我們得出如下最佳預(yù)測方程:
　　Age=13.828+0.425*BA+0.526*sex+0.0001*BW+

23、0.276*Tanner+20.418*cg1-11.828*cg2-5.881*cg3-10.951*cg4+7.828*cg5-5.768*cg8-10.854*cg9-6.048*cg10-9.174*cg11+6.529*cg16-24.577*cg20-8.782*cg23+7.594*cg24+8.399*cg26+7.451*cg27-9.605*cg28+17.739*cg30+18.913*cg38+14.427*cg

24、40-15.420*cg41-9.602*cg42
　　進(jìn)入方程的變量對(duì)方程均有不同程度貢獻(xiàn)，其中骨齡對(duì)方程的貢獻(xiàn)最大，其次是基因PRICKLE2(cg28)和基因APBA2(cg38)。該方程能解釋89.5％的年齡變異，估計(jì)年齡為10.37年(SD1.59)，對(duì)實(shí)際年齡低估0.1年，MAE為0.33年。年齡預(yù)測誤差在0.6年之內(nèi)，優(yōu)于其他各個(gè)篩選的方程，符合我們的研究要求，但尚待進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　4.結(jié)論:
　　4.

25、1.本研究通過全基因組甲基化芯片，首次在兒童青少年群體中完成年齡相關(guān)的基因甲基化位點(diǎn)的初步探索，并獲得了與年齡顯著相關(guān)的基因甲基化位點(diǎn)。
　　4.2.在年齡相關(guān)的44個(gè)基因甲基化位點(diǎn)中，大部分基因甲基化水平與年齡呈負(fù)相關(guān)。已知的31個(gè)基因均為蛋白質(zhì)編碼基因，分布于基因的內(nèi)部和上下游，主要參與細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)錄、分化、運(yùn)輸和代謝等多方面功能。
　　4.3.我們進(jìn)行了年齡預(yù)測模型相關(guān)探索，得出如下可行預(yù)測方程，該方程的年齡預(yù)測誤差在

26、0.6年之內(nèi)，符合我們的研究要求，但尚待進(jìn)一步驗(yàn)證。具體方程如下:
　　Age=13.828+0.425*BA+0.526*sex+0.0001*BW+0.276*Tanner+20.418*cg1-11.828*cg2-5.881*cg3-10.951*cg4+7.828*cg5-5.768*cg8-10.854*cg9-6.048*cg10-9.174*cg11+6.529*cg16-24.577*cg20-8.782*cg2