兒童青少年生物學年齡判定方法研究.pdf

1、無論在醫(yī)學界、法醫(yī)界以及競技體育領(lǐng)域，都對人類實際年齡的準確判斷有著較大的需求。尤其在競技體育領(lǐng)域，準確判定運動員實際日歷年齡已經(jīng)成為了各國在推進體育公平性中面臨的最大挑戰(zhàn)。但是，由于年齡判定研究不僅需要涉及醫(yī)學不同領(lǐng)域的知識，甚至需要跨多個行業(yè)團隊的合作研究，因此盡管這一領(lǐng)域的研究已有較為悠久的歷史，但時至今日仍是個有爭議的話題?；诠驱g的推算方法是目前判定實際年齡最常用的方法之一，但其準確性受到越來越多的挑戰(zhàn)，尤其在體育競技領(lǐng)域中，

2、運動類型、年限以及青春發(fā)育等多種因素都會對骨齡造成較大的影響，單純依靠骨齡已經(jīng)無法滿足對年齡準確判定的需求。因而，尋求更準確的年齡推斷方法顯得尤為迫切。
　　本研究在對國內(nèi)外具有代表性的個體生物學年齡判定研究方法總結(jié)后，系統(tǒng)地分析了牙齒形態(tài)發(fā)育和基因甲基化水平的增齡性變化在兒童青少年生物學年齡判定研究中的特點，并進一步提取與生物學年齡密切相關(guān)的各種量化標志性指標，通過建立相關(guān)的數(shù)學模型，尋找多種量化指標的最佳組合，以期能在現(xiàn)有的水

3、平上，進一步提高個體實際年齡判定的精確性。本研究分兩個部分探討。
　　第一部分，基于牙齒形態(tài)學的生物學年齡判定方法研究
　　1.研究目的
　　1.1.比較和探索基于牙齒形態(tài)學的牙齡判定方法。
　　1.2.整合基于牙齒形態(tài)學的各項量化指標，探尋年齡預(yù)測模型，以期準確推斷實際年齡。
　　2.研究方法和內(nèi)容
　　本研究屬于橫斷面研究，共納入952份7～14歲正常樣本的口腔曲面斷層全景片，其中男孩414人(4

4、3.6％)，平均年齡為12.14歲(SD1.81)。首先，依據(jù)Demirjian牙齒發(fā)育階段圖譜，驗證漢族兒童青少年左、右下頜牙齒發(fā)育的一致性;進而根據(jù)相應(yīng)的牙齡換算方法，分別獲得左下頜7顆恒牙Demirjian法牙齡(M2 M1 PM2 PM1 C I2 I1，簡稱D7)、4顆恒牙Demirjian法Ⅰ(M2 M1 PM2 PM1，簡稱D4Ⅰ)、4顆恒牙Demirjian法Ⅱ(M2 PM2 PM1 I1，簡稱D4Ⅱ)和Willems法

5、(M2 M1 PM2 PM1 C I2 I1，簡稱W，為D7法的修正版本)四種牙齡判定值。再次，根據(jù)牙齒相關(guān)長度和寬度的改變，測量左下頜各恒牙的牙齒、牙髓和牙根的長度，牙根尖、牙體的寬度等，獲得Cameriere法相關(guān)變量（包括No，S，X1～X7和Xi）和改良Kvall法相關(guān)變量（包括單根牙I2、C和PM2的P、T和R等），并驗證Cameriere法（歐洲模型）在漢族人群中的應(yīng)用。最后，采用多元線性回歸分析，結(jié)合以上基于牙齒發(fā)育圖譜的

6、4種牙齡判定方法結(jié)果和測量法中的相關(guān)測量指標分別進行年齡預(yù)測模型探索。
　　3.研究結(jié)果
　　3.1.左、右下頜恒牙發(fā)育基本是一致的，依據(jù)Demirjian牙齒發(fā)育階段圖譜，兩側(cè)下頜牙齒發(fā)育階段的一致率在93％以上，Kappa值0.9以上。說明基于左下頜的恒牙相關(guān)測量指標可以代表整體下頜恒牙發(fā)育水平。但牙齒的發(fā)育有顯著性別差異，提示在進行牙齡判斷時應(yīng)考慮性別因素。
　　3.2.各種牙齡判定方法研究
　　3.2.1

7、.左下頜7顆恒牙Demirjian法和Willems法牙齡判定研究
　　該方法包括Demirjian法(D7)和Willems法。與實際年齡相比，除女孩Willems法牙齡外，男孩Willems法和Demirjian法牙齡對實際年齡均有高估(P＜0.001)，以Demirjian法更加明顯。其中，Demirjian法(D7)與實際年齡的差值為1.45年(SD1.24)(P＜0.001)，男孩為1.68年(SD1.29)，女孩為1.

8、28年(SD1.17);Willems與實際年齡的差值為0.16年(SD1.20)(P＜0.001)，男孩為0.36年(SD1.19)(P＜0.001)，女孩為0.02年(SD1.18)(P＞0.05)。
　　3.2.2.左下頜4顆恒牙Demirjian法牙齡判定方法研究
　　Demirjian4Ⅰ法和Demirjian4Ⅱ法的預(yù)測牙齡對實際年齡均存在高估現(xiàn)象(P＜0.01)。男孩Demirjian4Ⅰ法牙齡與實際年齡差值為

9、0.88年(SD1.46);女孩為0.21年(SD1.39);男孩Demirjian4Ⅱ法牙齡與實際年齡的差值為1.24年（SD1.22年），女孩為0.53年（SD1.21年）。
　　3.2.3.Cameriere法牙齡研究
　　根據(jù)Cameriere法年齡預(yù)測模型（歐洲模型），Age=8.387+0.282*sex-1.692*X5+0.835*No-0.116*S-0.139*SxNo，我們得到如下結(jié)果:實際年齡為12.

10、15歲(SD1.81)，Cameriere法牙齡為9.70歲(SD2.32)，估計年齡與實際年齡的差值為-2.49年(SD1.70)。其中，男孩的實際年齡為11.94歲(SD1.90)，Cameriere法牙齡為9.73歲(SD2.34)，比實際年齡低估2.45年(SD1.75);女孩的實際年齡為12.32歲(SD1.71)，估計牙齡為9.69歲(SD2.31)，比實際年齡低估2.52年(SD1.66)。無論男孩還是女孩，平均預(yù)測誤差均

11、大于2.5年以上。說明該預(yù)測方程并不合適中國兒童青少年人群。
　　3.3.各種判定方法的比較
　　Demirjian法（D7、D4Ⅰ和D4Ⅱ）、Willems法和Cameriere法等五種年齡判定方法中，以Willems法最準確，與實際年齡的差值為0.16年(SD1.19)，估計誤差為0.95年，有59.7％的牙齡值與實際年齡的差異在1歲以內(nèi)。Demirjian法(D7)對年齡的高估現(xiàn)象最明顯，與年齡的差值為1.45年(SD

12、1.24)，67.5％的Demirjian法(D7)牙齡比實際年齡高估1歲以上。最不準確的是Cameriere法，79.6％的Cameriere法牙齡比實際年齡低估1歲以上，與實際年齡的差值為-2.49年(SD1.70)，預(yù)測誤差為2.64年。
　　3.4.年齡預(yù)測模型探索
　　我們在分析四種牙齡判定法的基礎(chǔ)上，增加了其他牙齡測量指標（包括Cameriere法和改良的Kvall法），對年齡進行預(yù)測，得到如下最佳預(yù)測方程:

13、r>　　Age=9.738+0.284*W-0.019*S*No-3.737*X5-3.746*X3-0.293*RPM2（男孩）
　　Age=6.705+0.38* W-7.053*X4-0.052*S*No+2.863*RC（女孩）
　　進入男孩年齡預(yù)測方程有5個變量，女孩的預(yù)測方程有4個變量，Willems法牙齡對方程的貢獻均最大。男孩的年齡預(yù)測方程能解釋82.1％的變異，其判定年齡與實際年齡的差值為-0.03年(SD

14、0.70)，MAE為0.56年;女孩的年齡預(yù)測方程能解釋73.5％的變異，判定年齡與實際年齡的差值為-0.004年(SD0.84)，MAE為0.65年。
　　我們同時對104例含有身高和體重變量的人群數(shù)據(jù)進行模型探索，獲得如下預(yù)測方程:
　　Age=-5.799+0.242*W+0.096*Height-2.83*X4(boy)
　　Age=-1.267+0.229*W+0.080*Height+6.561*X6-0.

15、976*X7-0.301*S(girl)
　　該兩個方程的預(yù)測效力得到了明顯的提高，男孩的年齡預(yù)測方程能解釋89.3％的變異，判定年齡與實際年齡的差值為-0.07年(SD0.54)，MAE為0.43年;女孩的年齡預(yù)測方程能解釋88.0％的變異，女孩高估0.07年(SD0.67)，MAE為0.56年。但目前該方程使用的樣本量少，此處只做探索，建議進一步擴大樣本量后再確定。
　　3.5.骨齡、牙齡與年齡的關(guān)系探討
　　我們

16、對收集到的13例樣本進行了牙齡、骨齡和年齡關(guān)系的初步探討。左下頜各恒牙中以尖牙、第一前磨牙、第二前磨牙和第二磨牙的發(fā)育階段與骨齡和年齡的相關(guān)性最好(P＜0.05)，相關(guān)性最差的是中切牙。
　　骨齡、牙齡和兩者的平均值均與實際年齡有著較好的相關(guān)性(P＜0.01)，以Willems法相關(guān)性最強(r=0.85，P＜0.01);其次是骨齡和Willems法牙齡的平均值(r=0.79，P＜0.01);骨齡與年齡的相關(guān)系數(shù)為0.72(P＜0.

17、05)。與實際年齡的差值，骨齡為0.71年(SD1.74)，P＞0.05; Willems法為1.28年(SD1.40)，P＜0.05;差異最大是Demirjian法(D7)為2.42年(SD1.68)， P＜0.05。
　　4.結(jié)論
　　4.1.漢族兒童青少年左、右下頜恒牙發(fā)育基本是一致的，基于左下頜的恒牙相關(guān)指標可以代表整體下頜恒牙發(fā)育水平。牙齒發(fā)育有性別差異，提示在進行牙齡判斷時應(yīng)考慮性別因素。
　　4.2.根據(jù)

18、牙齒發(fā)育形態(tài)的增齡性變化來推斷個體生物學的年齡是可行的。以Willems法的準確性最高，但建議使用時需進一步修正。準確性最差是Cameriere法（歐洲模型）。Cameriere法（歐洲模型）不適合應(yīng)用在漢族兒童青少年。
　　4.3.針對7～14歲個體，按照下列預(yù)測模型進行個體的年齡判定，可提高準確性。該兩個預(yù)測方程在不同性別中的年齡預(yù)測誤差在1歲左右。
　　Age=9.738+0.284*W-0.019*S*No-3.73

19、7*X5-3.746*X3-0.293*RPM2（男孩）
　　Age=6.705+0.38* W-7.053*X4-0.052*S*No+2.863*RC（女孩）
　　4.4.本研究小樣本探索了結(jié)合牙齒全景片和身高、體重變量的預(yù)測模型，該預(yù)測模型的預(yù)測效力得到了明顯的提高，整合多個生物學指標可能將為進一步提高生物學年齡判定的準確性研究提供方向。
　　第二部分，DNA甲基化水平與兒童青少年年齡的相關(guān)性研究
　　1.

20、研究目的
　　1.1.利用全基因組甲基化芯片技術(shù)及生物信息學方法對正常兒童青少年的末梢指尖血進行全基因組甲基化水平研究，篩選年齡相關(guān)的基因甲基化位點。
　　1.2.整合基因甲基化位點和個體生物學信息，探索年齡預(yù)測模型，以期準確推斷個體兒童青少年的實際年齡。
　　2.研究方法
　　2.1.招募68例7～14歲正常兒童青少年，獲得65份合格的末梢指尖血樣本，并獲取包括骨齡、青春期發(fā)育的Tanner分期、身高、體重和出

21、生體重等在內(nèi)的個體基本信息。
　　2.2.純化和定量基因組DNA，采用人類全基因組甲基化芯片(450K Infinium MethylationBeadChip)，對全基因組中大于450000的CpG島或CpG位點進行甲基化分析。
　　3.結(jié)果
　　3.1.根據(jù)原始數(shù)據(jù)情況，我們篩選了與實際年齡的相關(guān)系數(shù)絕對值大于等于0.5的DNA甲基化位點。共得到44個甲基化基因位點，其中已知基因31個，未知基因13個。已知基因均為

22、蛋白質(zhì)編碼基因，主要分布于基因的內(nèi)部和上下游，參與人體的細胞生長、轉(zhuǎn)錄、分化、運輸和代謝等多方面功能。
　　3.2.共44個甲基化位點中，有41個基因位點的甲基化水平與年齡呈負相關(guān)，僅有三個基因位點的甲基化水平與實際年齡成正相關(guān)。
　　3.3.基于DNA甲基化水平的年齡預(yù)測模型探索
　　根據(jù)探索性分析，我們得出如下最佳預(yù)測方程:
　　Age=13.828+0.425*BA+0.526*sex+0.0001*BW+

23、0.276*Tanner+20.418*cg1-11.828*cg2-5.881*cg3-10.951*cg4+7.828*cg5-5.768*cg8-10.854*cg9-6.048*cg10-9.174*cg11+6.529*cg16-24.577*cg20-8.782*cg23+7.594*cg24+8.399*cg26+7.451*cg27-9.605*cg28+17.739*cg30+18.913*cg38+14.427*cg

24、40-15.420*cg41-9.602*cg42
　　進入方程的變量對方程均有不同程度貢獻，其中骨齡對方程的貢獻最大，其次是基因PRICKLE2(cg28)和基因APBA2(cg38)。該方程能解釋89.5％的年齡變異，估計年齡為10.37年(SD1.59)，對實際年齡低估0.1年，MAE為0.33年。年齡預(yù)測誤差在0.6年之內(nèi)，優(yōu)于其他各個篩選的方程，符合我們的研究要求，但尚待進一步驗證。
　　4.結(jié)論:
　　4.

25、1.本研究通過全基因組甲基化芯片，首次在兒童青少年群體中完成年齡相關(guān)的基因甲基化位點的初步探索，并獲得了與年齡顯著相關(guān)的基因甲基化位點。
　　4.2.在年齡相關(guān)的44個基因甲基化位點中，大部分基因甲基化水平與年齡呈負相關(guān)。已知的31個基因均為蛋白質(zhì)編碼基因，分布于基因的內(nèi)部和上下游，主要參與細胞生長、轉(zhuǎn)錄、分化、運輸和代謝等多方面功能。
　　4.3.我們進行了年齡預(yù)測模型相關(guān)探索，得出如下可行預(yù)測方程，該方程的年齡預(yù)測誤差在

26、0.6年之內(nèi)，符合我們的研究要求，但尚待進一步驗證。具體方程如下:
　　Age=13.828+0.425*BA+0.526*sex+0.0001*BW+0.276*Tanner+20.418*cg1-11.828*cg2-5.881*cg3-10.951*cg4+7.828*cg5-5.768*cg8-10.854*cg9-6.048*cg10-9.174*cg11+6.529*cg16-24.577*cg20-8.782*cg2