甲真菌病致病菌毒力因子的體外研究.pdf

1、研究背景:
　　 甲真菌病是目前甲病中最常見的疾患，占甲病的50％以上。重要致病菌為皮膚癬菌、酵母菌和非皮膚癬菌類菌。甲真菌病的發(fā)病率近年一直在增加，誘發(fā)因素有如潮濕的環(huán)境、鞋襪不透氣、反復(fù)的甲損傷、慢性疾病如糖尿病、外周血管障礙性疾病、HIV感染，還有其他的免疫抑制狀態(tài)這些易感因素都可能誘發(fā)甲真菌病。甲真菌病的發(fā)病率隨著年齡的增長而增加，近30％的患者為60歲的老年人。近年兒童的發(fā)病率也有報道。
　　 甲真菌病的研究一

2、直是皮膚真菌學(xué)研究的重點(diǎn)之一，現(xiàn)階段甲真菌病的體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵殉蔀榱搜芯吭摬〉囊粋€可靠的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，最適宜的研究對象無疑是人甲，但是由于需要符合的人甲很難獲得，所以豬甲板和牛甲板是甲真菌病最為理想的動物模型。建立一個科學(xué)、經(jīng)濟(jì)、簡單的體外甲真菌病模型對于探討不同真菌引起甲感染的發(fā)病機(jī)理及評估藥物治療甲病療效具有重要意義。
　　 引起甲真菌病最主要的致病菌為皮膚癬菌，皮膚癬菌引起的感染遍布全世界，在全球被認(rèn)為是一個重要的公共衛(wèi)生問題。

3、紅色毛癬菌屬于皮膚癬菌屬的毛癬菌屬，是分布最廣泛的親人性皮膚癬菌，占人類所有皮膚癬菌病的69.5％，親人性的紅色毛癬菌是臨床上最重要的致病菌。紅色毛癬菌最容易侵犯人和動物的皮膚角質(zhì)層、甲，寄生或腐生于表皮角質(zhì)、甲板和毛發(fā)的角蛋白組織中，引起各種癬病，且病程持久、難治愈、易復(fù)發(fā)。
　　 紅色毛癬菌的高發(fā)病率以及親人特性使得它成為了研究淺部真菌的典范。近年來，雖然許多學(xué)者對紅色毛癬菌的生物學(xué)特性進(jìn)行了一定研究，但還是有許多問題仍需要

4、解釋，尤其是紅色毛癬菌與角蛋白的關(guān)系，在角蛋白培養(yǎng)基上的生長特性，紅色色素產(chǎn)生的影響因素。目前，還沒有相關(guān)實(shí)驗(yàn)對紅色毛癬菌這個生物學(xué)特性進(jìn)行研究和報道。
　　 紅色毛癬菌最突出的生物學(xué)特點(diǎn)是嗜角蛋白性。角蛋白富含半胱氨酸，由于其含有很多的二硫鍵，所以結(jié)構(gòu)特別穩(wěn)定。紅色毛癬菌在侵襲組織的過程中可以產(chǎn)生許多蛋白水解酶，分解皮膚中的角蛋白、膠原蛋白、彈力蛋白成短肽和氨基酸，為其生長代謝提供所需養(yǎng)分，同時也有利于菌體向周圍組織擴(kuò)散及深層

5、組織侵入，因此，被認(rèn)為是主要的毒力因子。角蛋白酶是這些蛋白水解酶中研究最為深入的、毒力最為重要的一種。迄今為止，國內(nèi)外對真菌分泌角蛋白酶的研究較多，但主要集中在研究不同菌種分泌的角蛋白酶。但對于不利環(huán)境下的紅色毛癬菌如何適應(yīng)并致病？以及如何調(diào)節(jié)自身的角蛋白酶活力表達(dá)研究卻很少。本課題就甲真菌病的致病過程以及致病菌的毒力因子展開研究，包括以下三部分:
　　 第一部分甲真菌病模型的體外實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的:構(gòu)建甲真菌病體外模

6、型研究，以期觀察不同致病真菌侵襲甲板的過程。
　　 方法:我們使用豬甲作為體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停诿棵都装甯箓?cè)面中央黏粘了一個“O”型圈，將受試菌液加入“O”型圈內(nèi)，放入培養(yǎng)箱30℃培養(yǎng)。每日觀察真菌生長情況，并比較不同真菌穿透甲板的速率，同時用病理和電鏡的方法來觀察真菌侵襲甲板并在甲板中的生長情況。
　　 結(jié)果:我們成功的構(gòu)建了甲真菌病實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，觀察到皮膚癬菌以及白念珠菌侵襲角蛋白的大體形態(tài)學(xué)變化和微觀結(jié)構(gòu)改變。
　　

7、 結(jié)論:該模型設(shè)計(jì)具有科學(xué)性和創(chuàng)新性，比較接近臨床甲真菌病模型，該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ妥屛覀兏庇^的觀察到不同致病真菌侵襲甲板的過程。
　　 第二部分不同蛋白對紅色毛癬菌生物學(xué)特性影響研究
　　 目的:探討不同營養(yǎng)成分對紅色毛癬菌生長性狀的影響
　　 方法:將紅色毛癬菌以點(diǎn)接種方式分別接種于不同營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，如馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基、沙氏培養(yǎng)基、胰蛋白葡萄糖、角蛋白葡萄糖、葡萄糖培養(yǎng)基以及不含葡萄糖培養(yǎng)基上，在30℃培養(yǎng)，動

8、態(tài)觀察菌落形態(tài)、顏色、產(chǎn)孢情況并測量菌落直徑，繪制生長益線圖。
　　 結(jié)果:從菌落生長曲線形態(tài)大小來看，馬鈴薯葡萄糖和沙氏培養(yǎng)基蛋白質(zhì)含量豐富，為紅色毛癬菌生長提供了豐富的營養(yǎng)，故茵落生長直徑最大;而角蛋白培養(yǎng)基相對來說由于角蛋白營養(yǎng)稍差，故菌落生長直徑稍小;在沒有蛋白僅有葡萄糖作為碳源的情況下皮膚癬菌生長不良，而僅有瓊脂的情況下皮膚癬菌無法生長。
　　 結(jié)論:紅色毛癬菌在含有蛋白的培養(yǎng)基上生長良好，不含蛋白生長不良。同

9、時PH偏酸有助于產(chǎn)生紅色色素。
　　 第三部分甲真菌病致病菌角蛋白酶的動態(tài)測量
　　 目的:不同的底物對真菌角蛋白酶活性的影響以及紅色毛癬菌在不良環(huán)境下的致病性。
　　 方法:1、用不同底物（角蛋白、葡萄糖、胰蛋白胨）分別誘導(dǎo)不同真菌，應(yīng)用keratin——azure結(jié)合分光光度法培養(yǎng)上清液中的角蛋白酶活性。2、分別以不同蛋白為底物，紅色毛癬菌在H2O2、特比奈芬和伊曲康唑的作用刺激下，測量角蛋白酶活性。