內(nèi)源性一氧化氮對胃癌細胞凋亡的影響及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制研究.pdf

1、胃癌是我國常見的消化道腫瘤，病死率高。研究證實胃癌細胞中內(nèi)源性一氧化氮與胃癌細胞生存或凋亡有關(guān)。許多研究表明新發(fā)現(xiàn)的叉頭轉(zhuǎn)錄因子FKHRL1(FOXO3a)在許多細胞凋亡過程中起著十分重要的作用。ROCK蛋白酶是細胞凋亡過程中的效應(yīng)分子，有研究表明乳腺癌細胞中抑制內(nèi)源性一氧化氮產(chǎn)生能誘導(dǎo)癌細胞凋亡，其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制中有FKHRL1及ROCK蛋白酶的參與。然而一氧化氮(nitricoxide，NO)與ROCK蛋白酶及叉頭轉(zhuǎn)錄因子FKHRL1

2、之間相互作用的機制還不完全清楚。本研究應(yīng)用一氧化氮合酶抑制劑NG-甲基-L-精氨酸(L-NMMA)抑制SGC-7901胃癌細胞內(nèi)源性一氧化氮產(chǎn)生觀察胃癌細胞凋亡，并進一步探討SGC-7901胃癌細胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。 目的：探討L-NMMA對SGC-7901胃癌細胞凋亡的影響，并進一步探討其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的可能機制。 方法： 1.應(yīng)用硝酸酶還原法檢測不同時間(12h、24h、48h)、不同濃度(10μM、20μM、3

3、0μM、40μM、50μM)一氧化氮抑制劑NG-甲基-L-精氨酸(N<'G>-Monomethyl-L-arginine，L-NMMA)處理組及對照組中SGC-7901胃癌細胞培養(yǎng)液中NO濃度。 2.應(yīng)用流式細胞儀及缺口末端標記技術(shù)(TUNEL)方法檢測不同時間及不同濃度L-NMMA處理組及對照組中SGC-7901胃癌細胞凋亡。 3.應(yīng)用免疫熒光方法檢測不同時間及不同濃度L-NMMA處理組及對照組中SGC-7901胃癌細胞內(nèi)FK

4、HRL1蛋白、p-FKHRL1(thr-32，ser-253)蛋白及ROCK蛋白表達。 4.應(yīng)用Western blot方法檢測不同時間及不同濃度L-NMMA處理組及對照組中SGC-7901胃癌細胞中FKHRL1、p-FKHRL1(thr-32，set-253)及ROCK表達。 5.應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制SGC-7901胃癌細胞中FKHRL1表達，檢測L-NMMA處理組及對照組中SGC-7901胃癌細胞凋亡。 6

5、.應(yīng)用轉(zhuǎn)基因方法轉(zhuǎn)染野生型FKHRL1-HA和突變型FKHRL1-HAT32A基因，檢測SGC-7901胃癌細胞凋亡。 結(jié)果： 1.一氧化氮合酶抑制劑L-NMMA處理組與對照組比較，SGC-7901胃癌細胞凋亡明顯增多(P<0.01)。而且SGC-7901胃癌細胞凋亡與L-NMMA濃度有顯著相關(guān)性(P<0.01)，與處理時間無相關(guān)性(P>0.05)。半胱天冬蛋白酶(caspase)3、6、7、8、10抑制劑Z-DEVD—

6、fmk不能阻斷SGC-7901胃癌細胞凋亡。 2.免疫熒光檢測顯示L-NMMA處理組SGC-7901胃癌細胞胞核中叉頭轉(zhuǎn)錄因子FKHRL1呈強陽性表達，p-FKHRL1(thr-32)胞漿內(nèi)也呈強陽性表達，而p-FKHRL1(ser-253)在胞漿內(nèi)表達沒有明顯變化。p-FKHRL1(thr-32)強陽性組SGC-7901胃癌細胞胞漿內(nèi)ROCK蛋白也呈強陽性表達，統(tǒng)計學(xué)分析兩者有相關(guān)性(P<0.01)。 3.ROCK蛋白

7、激酶特異性抑制劑γ-27632明顯抑制L-NMMA誘導(dǎo)SGC-7901胃癌細胞凋亡(P<0.01)。磷酸肌醇化激酶(PI3K)特異性抑制劑wortmannin不能阻斷L-NMMA處理組FKHRL1(thr-32)蘇氨酸磷酸化。 4.用RNA干擾方法抑制SGC-7901胃癌細胞中叉頭轉(zhuǎn)錄因子FKHRL1表達，L-NMMA誘導(dǎo)SGC-7901胃癌細胞凋亡明顯減少(P<0.01)。 5.轉(zhuǎn)染野生型FKHRL1基因(FKHRL1

8、-HA)，SGC-7901胃癌細胞凋亡明顯增加(P<0.01)，而且內(nèi)源性NO產(chǎn)生明顯減少(P<0.01)。 結(jié)論： 1.內(nèi)源性一氧化氮抑制劑L-NMMA能誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡，可為今后臨床應(yīng)用L-NMMA治療胃癌提供實驗依據(jù)。 2.L-NMMA誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡的可能機制是抑制內(nèi)源性一氧化氮產(chǎn)生從而誘導(dǎo)叉頭轉(zhuǎn)錄因子FKHRL1的表達及FKHRL1蘇氨酸磷酸化(thr-32)，p-FKHRL1(thr-32)激活ROC