GADD153參與調(diào)控視網(wǎng)膜脫離后細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、目的:探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡途徑的轉(zhuǎn)錄因子GADD153是否參與調(diào)控視網(wǎng)膜脫離后的細(xì)胞凋亡過(guò)程。 方法:設(shè)計(jì)針對(duì)GADD153的有效RNA干擾片段，陽(yáng)性克隆經(jīng)過(guò)DNA測(cè)序鑒定后，進(jìn)行慢病毒小量包裝。慢病毒滴度測(cè)定后，用RT-PCR和Western方法在體外培養(yǎng)的293T細(xì)胞中進(jìn)行有效靶點(diǎn)的篩選，構(gòu)建以RHO為啟動(dòng)子的RNAi慢病毒載體。將GADD153-shRNA的慢病毒載體采用視網(wǎng)膜下注射和玻璃體腔內(nèi)注射的方式轉(zhuǎn)入Wistar大鼠

2、眼內(nèi)，通過(guò)熒光體視鏡，熒光顯微鏡等分別在活體、眼杯鋪片和冰凍切片上觀察GFP的表達(dá)情況。124只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（Z組）4只，視網(wǎng)膜脫離組(R組)40只，陰性病毒載體對(duì)照組（D組）40只和GADD153-shRNA慢病毒載體組（G組）40只。D組和G組雙眼采取視網(wǎng)膜下注射的方式將病毒轉(zhuǎn)入眼內(nèi)，14d后與R組一起行視網(wǎng)膜下注射10mg/ml 透明質(zhì)酸鈉制造視網(wǎng)膜脫離模型。在視網(wǎng)膜脫離后1d、2d、4d、6d摘除眼球制作石蠟病理切片或

3、取視網(wǎng)膜組織，用半定量RT-PCR 檢測(cè)GADD153、Bcl-2和Bax mRNA的表達(dá)；用Western blot檢測(cè)GADD153、Bcl-2和Bax蛋白水平的表達(dá)；運(yùn)用熒光TUNEL 聯(lián)合激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)視網(wǎng)膜的細(xì)胞凋亡情況；運(yùn)用免疫熒光聯(lián)合激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)GADD153 在視網(wǎng)膜的表達(dá)與分布。 結(jié)果:DNA測(cè)序鑒定顯示重組質(zhì)粒中含有所設(shè)計(jì)的寡核昔酸單鏈，序列正確。轉(zhuǎn)染Lv-GADD-Sh-2的293T細(xì)胞中GA

4、DD153蛋白質(zhì)及基因表達(dá)水平顯著下降，Lv-GADD-Sh-2抑制GADD153表達(dá)的作用最強(qiáng)。成功構(gòu)建了以RHO為啟動(dòng)子的針對(duì)GADD153的慢病毒RNAi載體。視網(wǎng)膜下注射較玻璃體腔內(nèi)注射更有效，視網(wǎng)膜下注射組7d即能看到GFP表達(dá)，14d時(shí)表達(dá)到高峰且轉(zhuǎn)染到視網(wǎng)膜外層，2M時(shí)仍有表達(dá)，玻璃體腔內(nèi)注射組28d才有很微弱表達(dá)。與視網(wǎng)膜脫離組和陰性病毒載體對(duì)照組相比，GADD153-shRNA慢病毒載體組的GADD153和Bax的mR