新型細(xì)胞毒性化合物太白銀蓮花皂苷B誘導(dǎo)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究.pdf

1、神經(jīng)膠質(zhì)瘤(Glioma)是最常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性腫瘤,其發(fā)病率占全部顱內(nèi)腫瘤的40％,我國(guó)每年新查出此病患者為約為10萬(wàn)人,發(fā)病率高,預(yù)后差,盡管經(jīng)過(guò)積極的外科手術(shù)治療和化療,其中位生存時(shí)間仍然不超過(guò)一年時(shí)間。惡性膠質(zhì)瘤由于其內(nèi)在的本征性質(zhì),能夠逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視作用,能以很高的速度大范圍的擴(kuò)散?；瘜W(xué)治療膠質(zhì)瘤病人的最大難處在于藥物抵抗,不能有效的通過(guò)血腦屏障,所以發(fā)現(xiàn)和研究開(kāi)發(fā)更有效的藥物治療膠質(zhì)瘤就變得更加的有必要,更加的迫在

2、眉睫。中草藥已經(jīng)被廣泛的認(rèn)為在治療許多疾病中有很好的療效,比如從青蒿中提取的青蒿素和二氫青蒿素已經(jīng)被普遍的用于治療瘧疾,也有很多從植物中提取的成分有很好的抗腫瘤作用,比如從喜樹(shù)中提取的喜樹(shù)堿,從足葉草中提取的依托泊苷,從長(zhǎng)春花中提取的長(zhǎng)春新堿,從紅豆杉中提取的紫杉醇等。
　　太白銀蓮花(Anemone taipaiensis)為毛莨科,銀蓮花屬,產(chǎn)自我國(guó)陜西秦嶺,生長(zhǎng)于海拔2900-3700米間山地草坡或多石礫處。太白銀蓮花皂苷

3、B是第一次從太白銀蓮花中經(jīng)過(guò)系統(tǒng)化學(xué)分析和分離鑒定的皂苷之一,所以它的生物學(xué)效應(yīng)目前仍然不清楚。在本研究中,我們首次體外研究太白銀蓮花皂苷 B對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的生物學(xué)效應(yīng),觀察它對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的生長(zhǎng)抑制和凋亡作用,探索其對(duì)U87MG的生長(zhǎng)抑制和促凋亡作用,并進(jìn)一步分析它的作用機(jī)理。
　　實(shí)驗(yàn)一太白銀蓮花皂苷B對(duì)U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響
　　為了探索太白銀蓮花皂苷B對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制的細(xì)胞毒效應(yīng),應(yīng)用MTT分析經(jīng)過(guò)皂苷

4、B處理后的細(xì)胞的活力。皂苷B對(duì)U87MG細(xì)胞72h的抑制濃度為IC25=5.2μmol/L, IC50=6.7μmol/L and IC75=8.7μmol/L,U251細(xì)胞的抑制濃度為IC25=6.2μmol/L, IC50=7.9μmol/L and IC75=10.5μmol/L.在1.67-13.35μmol/L的劑量范圍內(nèi),皂苷B對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞在72h的時(shí)間進(jìn)程中有顯著的生長(zhǎng)抑制作用,呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴(lài)的細(xì)胞毒效應(yīng)。
　

5、　我們采用熒光顯微鏡觀察經(jīng)過(guò)皂苷B處理后膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的典型形態(tài)學(xué)變化,細(xì)胞經(jīng)過(guò)Hoechst33342染色,8h和24h的處理后,在IC25、IC50 and IC75濃度梯度下,熒光顯微鏡下觀察U87MG細(xì)胞凋亡形態(tài),染色質(zhì)凝集和核斷裂這些細(xì)胞凋亡的典型特征可以明顯的觀察到?？梢钥吹浇?jīng)過(guò)皂苷 B處理后,細(xì)胞皺縮成圓球形,細(xì)胞核碎裂或者致密濃染,向核膜邊緣聚集,染色質(zhì)濃縮為半月?tīng)?、?chē)輪狀或者馬蹄狀,凋亡小體出現(xiàn)。這些特征在24h時(shí)更明

6、顯。
　　實(shí)驗(yàn)二太白銀蓮花皂苷B誘導(dǎo)U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡
　　熒光素標(biāo)記的Annexin V能特異性的結(jié)合在外翻的磷脂酰絲氨酸(PS)的功能已經(jīng)被廣泛認(rèn)為是細(xì)胞凋亡可靠的一個(gè)標(biāo)記物,在太白銀蓮花皂苷 B終濃度為5.2μmol/L,6.7μmol/L and8.7μmol/L時(shí)分別作用8h和24h后,流式檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn),對(duì)照組細(xì)胞凋亡很少,處理組的凋亡細(xì)胞(Q2和Q4象限)有明顯的升高,壞死的細(xì)胞量(Q1象限)很少,24h時(shí)

7、,在濃度8.7μmol/L處理后,早期凋亡和晚期凋亡的細(xì)胞量達(dá)到91.5%。細(xì)胞經(jīng)過(guò)IC25, IC50and IC75濃度處理,24h后,采用流式細(xì)胞術(shù)觀察經(jīng)過(guò)PI染色的細(xì)胞周期變化。在細(xì)胞周期中,可以發(fā)現(xiàn)大量的細(xì)胞聚積在S期, G0/G1期的細(xì)胞比例隨著時(shí)間而下降,同時(shí)S期和G2/M期細(xì)胞數(shù)量增加,這些特征在濃度IC75的時(shí)候最顯著,這些說(shuō)明皂苷B抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)是以劑量依賴(lài)的方式引起了細(xì)胞周期中的S期的阻滯。
　　實(shí)驗(yàn)三太

8、白銀蓮花皂苷B誘導(dǎo)U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制
　　為了進(jìn)一步的研究皂苷B對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用,我們采用DNA Ladder來(lái)分析皂苷對(duì)DNA合成的影響,細(xì)胞經(jīng)過(guò)24h的處理后,細(xì)胞DNA呈現(xiàn)出了典型的梯帶狀,說(shuō)明皂苷處理后,細(xì)胞的DNA斷裂。凋亡是一個(gè)需要能量的的生理性的過(guò)程,它的特征就是具有遺傳背景的細(xì)胞內(nèi)的凋亡小體的形成,可以發(fā)現(xiàn),皂苷 B誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡是通過(guò)引起特定的DNA斷裂而產(chǎn)生。眾所周知,Caspase

9、家族的活化是細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要事件,Bcl-2家族包括Bcl-2、Bcl-xl、Bad, Bax、Bad促進(jìn)細(xì)胞程序性死亡,而B(niǎo)cl-XL則抑制細(xì)胞死亡,以前的關(guān)于抗癌藥物的研究也表明細(xì)胞的凋亡有 Bcl-2基因的參與。通過(guò)研究結(jié)果可見(jiàn),經(jīng)過(guò)太白銀蓮花皂苷 B處理后,處理組的Bax,Caspase-3, FasL的表達(dá)上調(diào),Bcl-2的表達(dá)上調(diào),β-Actin的表達(dá)用來(lái)確保每個(gè)孔的蛋白上樣量的均一?？梢园l(fā)現(xiàn),促凋亡蛋白(Caspase-

10、3,Bax,FasL)的促凋亡作用有時(shí)間和劑量的依賴(lài)效應(yīng),同樣,這一現(xiàn)象也可以在Bcl-2的表達(dá)上觀察的到。通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),太白銀蓮花皂苷B對(duì)人類(lèi)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87MG有強(qiáng)烈的劑量和時(shí)間依賴(lài)性的細(xì)胞毒效應(yīng),通過(guò)活化線(xiàn)粒體凋亡途徑和死亡受體途徑顯著的誘導(dǎo)了U87MG細(xì)胞的凋亡。
　　以上研究表明,太白銀蓮花皂苷B對(duì)惡性膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞有強(qiáng)烈的細(xì)胞毒效應(yīng),其抗腫瘤作用可能有多種生物機(jī)制的參與,比如干涉細(xì)胞周期進(jìn)程和促進(jìn)凋