樹突狀細胞表面C型凝集素受體CLEC-2表達差異對滋養(yǎng)細胞生物學行為的影響.pdf

1、第一部分CLEC-2過表達/siRNA慢病毒載體的構(gòu)建及其瞬時轉(zhuǎn)染樹突狀細胞
　　目的：構(gòu)建C型凝集素受體（C-type lectin receptors,CLRs）CLEC-2過表達/siRNA慢病毒（lentivirus）載體，并將其瞬時轉(zhuǎn)染樹突狀細胞（Dendritic Cell,DC）。
　　方法：
　　1.免疫磁珠分離、培養(yǎng)以及鑒定胎盤和蛻膜來源的DC；
　　2.構(gòu)建CLEC-2過表達/siRNA慢病毒

2、載體并轉(zhuǎn)染DC；
　　3.抽提轉(zhuǎn)染CLEC-2過表達/siRNA慢病毒后的DC的總RNA；
　　4.Real-Time PCR檢測DC轉(zhuǎn)染慢病毒前后的CLEC-2基因mRNA表達量。
　　結(jié)果：
　　1.從胎盤分離純化得到的DC，經(jīng)流式細胞術檢測其純度為（82.6±2.4）％；
　　2.根據(jù)Genebank數(shù)據(jù)庫成功構(gòu)建了過表達CLEC-2基因慢病毒及CLEC-2基因siRNA慢病毒，病毒量為1×1010U

3、nit；3.將構(gòu)建的兩種慢病毒轉(zhuǎn)染DC后，在熒光倒置顯微鏡下可觀察到：被轉(zhuǎn)染的陽性細胞有綠色熒光蛋白（GTP）表達，通過流式細胞儀檢測,轉(zhuǎn)染效率分別為85%及82%左右；4.Real-Time PCR檢測發(fā)現(xiàn)過表達CLEC-2基因慢病毒轉(zhuǎn)染DC后mRNA相對含量均值為（14.26±0.47）%，較空白未轉(zhuǎn)染的DC表達量（（1.67±0.19）%）有明顯上升（P<0.01）；CLEC-2基因siRNA慢病毒轉(zhuǎn)染DC后CLEC-2的mRNA

4、相對含量均值為（0.03±0.01）%，較空白未轉(zhuǎn)染的DC表達量明顯下降（P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.成功構(gòu)建了表達人CLEC-2-siRNA的慢病毒載體，它能有效沉默CLEC-2基因在胎盤DC中的表達并獲得了其瞬時轉(zhuǎn)染的DC；
　　2.成功構(gòu)建了過表達CLEC-2的慢病毒載體，它能有效的在體內(nèi)發(fā)揮基因過表達效應并獲得了其瞬時轉(zhuǎn)染的DC。
　　第二部分樹突狀細胞表面CLEC-2表達差異對滋養(yǎng)細胞生物學行

5、為的影響
　　目的：采用基因克隆技術構(gòu)建CLEC-2過表達/siRNA慢病毒載體，觀察胎盤來源的樹突狀細胞（DC）表面CLEC-2過表達或低表達對人絨毛外細胞滋養(yǎng)細胞（extravillous cytotrophoblasts，EVCT）侵襲力、粘附力及凋亡率的影響。
　　方法：
　　1.通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和RNA干擾技術獲取過表達CLEC-2的DC和低表達CLEC-2基因的DC；
　　2.分離、培養(yǎng)以及鑒定人原代絨毛

6、外細胞滋養(yǎng)細胞，然后與過表達CLEC-2基因的DC和低表達CLEC-2基因的DC共培養(yǎng)；
　　3.體外侵襲試驗，檢測共培養(yǎng)前后的滋養(yǎng)細胞侵襲能力；Annexin V/PI雙染法檢測共培養(yǎng)前后滋養(yǎng)細胞的凋亡情況；粘附能力實驗檢測共培養(yǎng)前后滋養(yǎng)細胞的粘附能力。
　　結(jié)果：
　　1.侵襲能力：EVCT與過表達CLEC-2基因的DC及T、自然殺傷細胞（Natural killer cells，NK）共培養(yǎng)后侵襲能力與對照組相比

7、無顯著性差異（P>0.05）；而EVCT與低表達組的DC及T、NK細胞共培養(yǎng)后侵襲能力明顯弱于對照組，（P<0.01）；
　　2.凋亡率：EVCT與過表達組的DC及T、NK細胞共培養(yǎng)后凋亡率為（3.9±0.8）%，與對照組的凋亡率（1.1±0.3）%相比無顯著性差異。而EVCT與低表達組的DC及T、NK細胞共培養(yǎng)后凋亡率為（8.2±1.4）%，與對照組相比，凋亡率明顯增加（P<0.01）；
　　3.粘附能力：過表達組EVCT