篩選高效低毒天花粉蛋白衍生肽誘導(dǎo)同種異體移植耐受的研究.pdf

1、天花粉蛋白（Trichosanthin，Tk）是從植物括簍根塊中提取的堿性蛋白，我們前期的研究首次發(fā)現(xiàn)其具有免疫負(fù)向調(diào)節(jié)功能，可抑制Th1型主宰的細(xì)胞應(yīng)答，是一種潛在的免疫抑制劑。然而Tk在臨床使用時(shí)伴隨一定的肌肉和神經(jīng)毒性，因此明確 Tk分子的構(gòu)效關(guān)系顯得尤為重要。為此，我們對(duì)Tk進(jìn)行了分段克隆和表位分析，篩選獲得低毒高效的衍生肽Tk-PQ，并分析其誘導(dǎo)同種異體移植耐受的作用及機(jī)制，為其應(yīng)用臨床奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。我們?cè)隗w外建立同種異體 M

2、LR體系，體內(nèi)構(gòu)建小鼠同種異體皮膚移植模型，3H-TdR摻入法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Tk-PQ對(duì)MLR具有顯著抑制效果，抑制率達(dá)87％（P＜0.01）；乳酸脫氫酶（LDH）及Annexin-V/PI檢測(cè)法證明Tk-PQ對(duì)細(xì)胞毒性作用與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異。皮膚移植實(shí)驗(yàn)表明，Tk-PQ治療后，小鼠同種異體皮膚移植物的生存期平均由8.4天延長(zhǎng)至22.6天（P＜0.01）；HE染色顯示，治療組移植皮膚局部炎性浸潤(rùn)減輕。采用real-time PCR、EL

3、ISA、FACS等方法分析發(fā)現(xiàn)，Tk-PQ可顯著上調(diào)CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞（nTreg）比例，細(xì)胞因子IL-10、TGF-β分泌水平升高，IL-2、IFN-γ、IL-17A分泌水平降低。Western blotting和co-IP結(jié)果顯示，Tk-PQ可增強(qiáng)IRF4表達(dá)水平；此外，Western blotting和real-time PCR結(jié)果提示Tk-PQ可通過(guò)抑制I-κB磷酸化阻止NF-κB的活化入核，從而抑制NF-κB

4、下游炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)。由此得出以下結(jié)論，篩選出的Tk衍生肽—Tk-PQ對(duì)Th1/Th17型主宰的免疫應(yīng)答具有明顯免疫抑制作用，抑制效果優(yōu)于全長(zhǎng)蛋白而細(xì)胞毒性低于Tk；體內(nèi)功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)其能顯著延長(zhǎng)小鼠同種異體移植皮膚的生存期，其中可能涉及的作用機(jī)制包括：上調(diào)CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞比例及細(xì)胞因子IL-10、TGF-β分泌，下調(diào)IFN-γ、IL-17A等的表達(dá)水平，增強(qiáng) IRF4乙酰化水平，抑制