濕熱痹片抗炎鎮(zhèn)痛作用及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、1、目的與意義: 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一種以慢性炎癥、異常免疫反應(yīng)和滑膜增生為特征的全身性自身免疫性疾病，危害嚴(yán)重，致殘率高，目前尚無(wú)特異的有效治療方法。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，全世界成人患病率為0.5～1.5%，在我國(guó)成人RA患病率約為0.4%。近年來(lái)的研究認(rèn)為，RA典型的病理特征為炎癥滑膜增生、單核細(xì)胞浸潤(rùn)和新生血管形成，生長(zhǎng)特征類似于局限性侵襲性生長(zhǎng)的腫瘤，所以類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎不能被

2、看作是一個(gè)良性的疾病，它嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，并能縮短患者壽命，可能是一種局部侵襲性腫瘤，有”第二癌癥”之稱。臨床上對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療主要是緩解疼痛、減輕炎癥、保護(hù)肌肉和關(guān)節(jié)功能等。 RA的病因病機(jī)至今尚無(wú)定論，但普遍認(rèn)為該病是在遺傳易感性的基礎(chǔ)上，由外界因素誘發(fā)的一種疾病。其中T細(xì)胞譜系是認(rèn)識(shí)RA病理機(jī)制的里程碑，許多研究證實(shí)，T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)異常是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的主要發(fā)病機(jī)制，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜組織中有大量T淋巴細(xì)胞浸

3、潤(rùn)，或彌漫性、或在血管附近灶狀分布。尤其是CD4+/CD8+T細(xì)胞動(dòng)態(tài)平衡的失調(diào)在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的激發(fā)和延續(xù)密切相關(guān)。 濕熱痹片由蒼術(shù)、忍冬藤、地龍、連翹、黃柏、薏苡仁、防風(fēng)、川牛膝、威靈仙、粉萆薜、防己組成，方中蒼術(shù)、薏苡仁健脾利濕；防風(fēng)、粉萆薢祛風(fēng)除濕；忍冬藤、連翹、黃柏清熱散結(jié)；再配與防己、威靈仙、地龍、川牛膝、桑枝祛風(fēng)濕通絡(luò)止痛。諸藥相配合，共湊祛風(fēng)除濕、清熱消腫、通絡(luò)定痛之功。本課題

4、采用小鼠疼痛和炎癥模型來(lái)觀察濕熱痹片的抗炎鎮(zhèn)痛效果，以大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎（Adjuvant Arthritis，AA）模型觀察濕熱痹片對(duì)關(guān)節(jié)炎癥及滑膜病理改變的影響，并探討其相關(guān)作用機(jī)制。 2、實(shí)驗(yàn)方法: 2.1,濕熱痹片抗炎鎮(zhèn)痛作用的實(shí)驗(yàn)研究。 2.1. 1,小鼠熱板實(shí)驗(yàn)。 取體重18～22g的昆明種雌性小鼠，置于（55±0.5）℃熱板上，觀察小鼠從放入至舔后足所需時(shí)間（s），記錄并作為痛閾指標(biāo)。選擇痛閾

5、值在10～30s的小鼠40只，隨機(jī)分為4組，即空白對(duì)照組、布洛芬組和濕熱痹片低、高劑量組，每組10只。每天每只小鼠灌胃給予0.5 mL的相應(yīng)受試藥物，空白對(duì)照組給予等容積生理鹽水，連續(xù)4d。記錄末次給藥后60min的痛閾值。 2.1.2,小鼠扭體實(shí)驗(yàn)。 取昆明種雄性小鼠40只，隨機(jī)分為4組，即模型對(duì)照組、布洛芬組和濕熱痹片低、高劑量組，每組10只。每天每只小鼠灌胃給予0.5 mL的相應(yīng)受試藥物，模型對(duì)照組給予等容積生理鹽

6、水，連續(xù)4d。于末次給藥30 min后，各組小鼠腹腔注射0.6%冰醋酸10 mL/kg，觀察記錄20 min內(nèi)每只小鼠出現(xiàn)扭體反應(yīng)的次數(shù)。 2.1.3,二甲苯致小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)。 取昆明種雄性小鼠40只，隨機(jī)分為4組，即模型對(duì)照組、強(qiáng)的松組和濕熱痹片低、高劑量組，每天每只小鼠灌胃給予0.5 mL的相應(yīng)受試藥物，模型對(duì)照組給予等容積生理鹽水，連續(xù)4d。于末次給藥30min后，每鼠右側(cè)耳廓正反面均勻涂抹二甲苯15μl，15mi

7、n后脫臼處死，沿耳廓對(duì)稱剪下小鼠兩耳，用打孔器在左右耳廓相同部位打孔取材，精密電子天平稱量，計(jì)算腫脹度及抑制率。腫脹度（mg）=右耳片重-左耳片重。 2.1.4,小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高實(shí)驗(yàn)。 取昆明種雄性小鼠40只，隨機(jī)分為4組，分組及給藥方法同小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)。于末次給30min藥后，各小鼠尾靜脈注射0.5%依文思蘭溶液，隨即腹腔注射0.6%的冰醋酸溶液，20min后脫頸椎處死，腹腔注射5ml生理鹽水，輕揉小鼠腹部，

8、使腹腔內(nèi)染料充分溶于生理鹽水中并混合均勻，剪開(kāi)腹部肌肉，吸管吸出洗滌液，離心，取上清液在紫外分光光度計(jì)上595nm比色測(cè)定吸光度（OD）值。 2.2,濕熱痹片對(duì)Mtb誘導(dǎo)AA大鼠的影響。 選取雄性SD大鼠50只，隨機(jī)分為5組，即空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、LEF組和濕熱痹片低、高劑量組。除空白對(duì)照組大鼠外，其他各組大鼠免疫M(jìn)tb誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。從免疫M(jìn)tb當(dāng)天開(kāi)始灌胃給藥，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組給予等容積生理鹽水，連

9、續(xù)給藥28天。給藥過(guò)程中紀(jì)錄各組大鼠足容積及炎癥積分的變化。第28天大鼠經(jīng)水合氯醛麻醉后，用X光攝片機(jī)對(duì)大鼠后肢拍攝X線片，觀察大鼠足關(guān)節(jié)病變情況。而后處死大鼠，膝、踝關(guān)節(jié)取材，常規(guī)石蠟切片HE染色，進(jìn)行組織學(xué)觀察。 2.3,濕熱痹片藥理機(jī)制的探討。 2.3.1, AA大鼠T淋巴細(xì)胞亞群的測(cè)定。 大鼠給藥28d后，以水合氯醛麻醉，經(jīng)腹主動(dòng)脈用抗凝管采血100μl，依次加入APC-CD4、PE-CD8抗體，漩渦混勻

10、，再加入紅細(xì)胞裂解液，離心，以PBS洗滌3次，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+、CD8+T細(xì)胞水平。 2.3.2, TNF-α水平檢測(cè)。 給藥28天后，大鼠水合氯醛麻醉，經(jīng)腹主動(dòng)脈取不抗凝血液標(biāo)本。5×103rpm離心15min，吸取上清液凍存于-20℃。采用ELISA方法檢測(cè)TNF-α水平，具體操作步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。 2.3.3, IL-1、IL-10和VEGF水平檢測(cè) 給藥28天后處死大鼠，截取右側(cè)后足，取出

11、踝關(guān)節(jié)滑膜組織，按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行提取并測(cè)定IL-1、IL-10和VEGF濃度，均采用ELISA方法。 3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 3.1,濕熱痹片抗炎鎮(zhèn)痛作用的實(shí)驗(yàn)研究。 在熱板實(shí)驗(yàn)中，與空白對(duì)照組相比較，布洛芬組、濕熱痹片低、高劑量組的痛閾值呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果表明具有顯著性差異（P<0.05）；在扭體實(shí)驗(yàn)中，與模型對(duì)照組相比，布洛芬組、濕熱痹片低、高劑量組的小鼠在20min內(nèi)扭體次顯著減少（P<0.01）。以上結(jié)果提

12、示各個(gè)藥物組對(duì)小鼠疼痛反應(yīng)具有抑制作用。在耳腫脹實(shí)驗(yàn)中，強(qiáng)的松組及濕熱痹片低、高劑量組的腫脹度均低于模型對(duì)照組，提示各個(gè)藥物組均能抑制二甲苯致小鼠耳廓腫脹度，對(duì)急性炎癥具有抑制作用；在腹腔毛細(xì)血管通透性增高實(shí)驗(yàn)中，強(qiáng)的松組、濕熱痹片低、高劑量組的OD值均低于模型對(duì)照組，提示強(qiáng)的松和濕熱痹片均能抑制冰醋酸所致的小鼠毛細(xì)血管通透性增高，使腹腔滲出的染料減少，對(duì)急性滲出性炎癥顯示出抗炎作用。 3.2,濕熱痹片對(duì)AA大鼠關(guān)節(jié)炎癥及病理改

13、變的影響。 大鼠免疫M(jìn)tb后，大鼠足腫脹度與炎癥積分在不同時(shí)間點(diǎn)的改變趨勢(shì)基本一致，且不同觀察組之間的變化均具有顯著性差異。模型組的平均腫脹度和炎癥積分均高于其他觀察組。而濕熱痹片低、高劑量組的足腫脹度和炎癥積分從第13天和第16天開(kāi)始后就表現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，這說(shuō)明濕熱痹片對(duì)AA的急性期炎癥有較好的抑制作用。從X線攝片和病理切片的觀察結(jié)果來(lái)看，LEF組和濕熱痹片低、高劑量組大鼠關(guān)節(jié)骨質(zhì)及滑膜破壞較模型組明顯改善，說(shuō)明LEF、濕熱痹

14、片對(duì)AA急性期炎癥有一定的抑制作用，濕熱痹片能抑制AA的發(fā)生和發(fā)展。 3.3,濕熱痹片抗炎作用相關(guān)機(jī)制研究。 3.3.1,濕熱痹片對(duì)大鼠外周血T-淋巴細(xì)胞亞群的影響。 空白對(duì)照組、模型組、LEF組、濕熱痹片低、高劑量組之間的CD8+T細(xì)胞含量有顯著性差異，CD4+T細(xì)胞含量無(wú)顯著性差異，同時(shí)CD4+/CD8+差異顯著。LEF組、濕熱痹片低、高劑量組的CD8+T細(xì)胞含量與模型組相比顯著升高（P<0.05），CD4+

15、/CD8+的比值下降（P<0.05）。 3.3.2,對(duì)促炎細(xì)胞因子的影響。 空白對(duì)照組、模型組、LEF組、濕熱痹片低、高劑量組的TNF-α、IL-1和VEGF濃度均有顯著性差異。和空白對(duì)照比，模型組的TNF-α、IL-1和VEGF濃度均上升（P<0.05=；和模型組相比，LEF組、濕熱痹片低、高劑量組的TNF-α、IL-1和VEGF濃度均顯著降低（P<0.05）。 3.3.3,對(duì)抗炎細(xì)胞因子的影響。 空白

16、對(duì)照組、模型組、LEF組、濕熱痹片低、高劑量組滑膜組織中IL-10濃度有顯著性差異。和空白對(duì)照比，模型組的IL-10濃度無(wú)明顯變化；和模型組比較，LEF組、濕熱痹片低、高劑量組的IL-10濃度顯著上升（P<0.05）。 4、研究結(jié)論: 4.1,濕熱痹片有較好的抗炎、鎮(zhèn)痛作用。在小鼠實(shí)驗(yàn)中，濕熱痹片能夠延長(zhǎng)物理刺激和化學(xué)物質(zhì)所引起的急性疼痛的痛閾，抑制二甲苯導(dǎo)致的鼠耳腫脹度和冰醋酸引起的腹腔血管通透性的升高。 4.

17、2,濕熱痹片能夠抑制大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎急性期炎癥，降低炎癥嚴(yán)重程度，能夠抑制AA炎癥發(fā)展過(guò)程中滑膜增生、纖維化、炎細(xì)胞浸潤(rùn)、軟骨和骨的破壞等一系列改變。 4.3,濕熱痹片抗炎鎮(zhèn)痛作用藥理機(jī)制與調(diào)節(jié)T-細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子水平相關(guān)：濕熱痹片通過(guò)上調(diào)CD8+T細(xì)胞水平維持T細(xì)胞亞群平衡來(lái)發(fā)揮對(duì)炎癥的抑制作用；濕熱痹片通過(guò)下調(diào)促炎因子TNF-α、IL-1及VEGF水平，上調(diào)抗炎因子IL-10水平，維持細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)平衡抑制RA的發(fā)生和延續(xù)。