植入期二硫化碳暴露對(duì)小鼠子宮組織氧化應(yīng)激、DNA損傷及甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的影響.pdf

1、研究背景
　　二硫化碳(Carbondisulfide，CS2)是工業(yè)上常用的有機(jī)溶劑和化工原料，廣泛用于粘膠纖維、玻璃紙、橡膠等的生產(chǎn)過(guò)程中。CS2具有多系統(tǒng)毒性，長(zhǎng)期低劑量暴露于CS2可導(dǎo)致神經(jīng)、心血管、內(nèi)分泌系統(tǒng)等的病變。此外，值得關(guān)注的是CS2具有明顯的生殖損傷毒作用，可導(dǎo)致男性睪丸萎縮、精子質(zhì)量下降、性功能減退、性激素分泌紊亂等，并可導(dǎo)致女性月經(jīng)周期紊亂、自然流產(chǎn)、早產(chǎn)等。本課題組通過(guò)前瞻性隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)，暴露組女工早早孕

2、丟失率顯著高于對(duì)照組，并且暴露組女工的妊娠時(shí)間與對(duì)照組相比明顯延長(zhǎng)，說(shuō)明CS2影響胚胎的著床過(guò)程。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，小鼠在圍植入期暴露于CS2導(dǎo)致胚胎植入數(shù)目明顯減少，但其毒性作用機(jī)制尚未明確。
　　氧化應(yīng)激可以導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化、DNA損傷及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的改變。研究表明，接觸CS2可引起機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)，機(jī)體處于高氧化應(yīng)激水平可增加自然流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)。提示孕期CS2暴露可以通過(guò)改變機(jī)體的氧化應(yīng)激水平而影響胚胎正常著床。課題組前期實(shí)驗(yàn)

3、結(jié)果顯示，胚胎植入期暴露于CS2可導(dǎo)致孕鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞DNA損傷，但與氧化應(yīng)激的關(guān)系尚不明確。DNA甲基化可以影響基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程調(diào)節(jié)植入相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，影響胚胎植入。DNA甲基化在調(diào)節(jié)基因功能過(guò)程中需要甲基轉(zhuǎn)移酶（DNAmethyltransferase，DNMT）的參與。Logan等研究發(fā)現(xiàn)，低甲基化水平可以增強(qiáng)子宮內(nèi)膜對(duì)胚胎的容受性，有利于胚胎植入。氧化應(yīng)激可引起機(jī)體DNA甲基化水平的改變，同時(shí)氧化應(yīng)激導(dǎo)致的DNA氧化損傷可啟動(dòng)機(jī)

4、體的堿基切除修復(fù)過(guò)程，而參與堿基切除修復(fù)的有關(guān)酶需要經(jīng)過(guò)甲基化后才能發(fā)揮作用。綜上，我們推測(cè)在DNA氧化損傷后，需要DNMT的高表達(dá)以啟動(dòng)DNA損傷修復(fù)過(guò)程。因此，我們假設(shè)在孕鼠暴露于CS2后，氧化應(yīng)激、DNA損傷和DNA甲基化的單獨(dú)或聯(lián)合作用是胚胎植入障礙的重要機(jī)制。
　　本研究擬運(yùn)用不同胚胎植入時(shí)段CS2暴露與胚胎植入障礙關(guān)系的時(shí)間依賴動(dòng)物模型，檢測(cè)暴露后不同染毒時(shí)間點(diǎn)和觀察終點(diǎn)孕鼠子宮組織的氧化應(yīng)激、子宮內(nèi)膜細(xì)胞DNA損傷、

5、DNA氧化損傷生物標(biāo)志物8-OH-dG以及DNMT表達(dá)水平，探討氧化應(yīng)激、DNA損傷及DNA甲基化在CS2致胚胎植入障礙中的毒性作用機(jī)制。
　　研究目的
　　構(gòu)建胚胎植入期不同時(shí)點(diǎn)暴露于CS2致胚胎植入障礙動(dòng)物模型，檢測(cè)不同染毒時(shí)間點(diǎn)與不同觀察終點(diǎn)的孕鼠子宮組織氧化應(yīng)激、子宮內(nèi)膜細(xì)胞DNA損傷、8-OH-dG以及DNMT表達(dá)水平，分析氧化應(yīng)激、DNA損傷和DNA甲基化在CS2所致的胚胎植入障礙中的作用及其致病機(jī)制，進(jìn)一步加深

6、對(duì)圍植入期CS2暴露所致胚胎植入障礙毒作用機(jī)制的了解，為環(huán)境因素生殖損傷研究提供可借鑒的理論依據(jù)和研究方法。
　　研究方法
　　1.研究設(shè)計(jì)
　　研究設(shè)計(jì)分為三部分。第一部分用于建立CS2暴露致胚胎植入障礙時(shí)間依賴動(dòng)物模型，通過(guò)胚胎植入障礙現(xiàn)象尋找CS2致胚胎植入障礙敏感暴露時(shí)間點(diǎn)，并檢測(cè)孕鼠子宮組織氧化應(yīng)激水平，分析氧化應(yīng)激在CS2致胚胎植入障礙機(jī)制中的作用。第二部分在第一部分實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇CS2致胚胎植入障礙敏

7、感時(shí)點(diǎn)使孕鼠暴露于CS2，并在不同時(shí)點(diǎn)終止實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)孕鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞DNA損傷和子宮組織8-OH-dG水平，分析在CS2致胚胎植入障礙毒作用機(jī)制中DNA損傷的作用及DNA損傷與氧化應(yīng)激的關(guān)系。第三部分動(dòng)物處理同第二部分，檢測(cè)孕鼠子宮組織中DNMT表達(dá)水平，分析在CS2致胚胎植入障礙毒作用機(jī)制中DNA甲基化的作用。
　　2.暴露時(shí)間
　　本實(shí)驗(yàn)根據(jù)CS2暴露時(shí)間的不同分為4種處理，即動(dòng)物分別在孕3d、孕4d、孕5d和孕6d（記

8、為GD3、GD4、GD5和GD6）接受一次處理（CS2或溶劑）。
　　3.觀察終點(diǎn)
　　選取暴露后的連續(xù)時(shí)間點(diǎn)作為觀察終點(diǎn)，四種處理共有26個(gè)觀察終點(diǎn)，即第一個(gè)處理組分別在暴露后第6h、12h、18h、24h、48h、72h、96h和144h（即GD9）共設(shè)有8個(gè)觀察終點(diǎn);第二個(gè)處理組分別在暴露后6h、12h、18h、24h、48h、72h和120h（即GD9）共設(shè)有7個(gè)觀察終點(diǎn);第三個(gè)處理組分別在暴露后6h、12h、18h

9、、24h、48h和96h（即GD9）共設(shè)有6個(gè)觀察終點(diǎn);第四個(gè)處理組分別在暴露后6h、12h、18h、24h和72h（即GD9）共設(shè)有5個(gè)觀察終點(diǎn)。
　　各處理組的最后1個(gè)觀察終點(diǎn)(GD9)用于觀察母體毒性及胚胎植入數(shù)目，其余各觀察終點(diǎn)用于檢測(cè)氧化應(yīng)激、DNA損傷及DNMT1表達(dá)水平等。每個(gè)觀察終點(diǎn)包含1個(gè)CS2暴露組和1個(gè)溶劑對(duì)照組。
　　4.動(dòng)物受孕與分組
　　實(shí)驗(yàn)前清潔級(jí)性成熟昆明種小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，按雌雄1∶

10、1合籠，次日晨檢查陰栓，陰栓陽(yáng)性者記為孕第一天（記為GD1），隨機(jī)分到26個(gè)觀察終點(diǎn)。每個(gè)觀察終點(diǎn)組含12只孕鼠，再隨機(jī)分配進(jìn)入暴露組和對(duì)照組（各含6只孕鼠）。
　　5.孕鼠處理
　　孕鼠分別按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的暴露時(shí)點(diǎn)接受1次腹腔注射（CS2暴露劑量為631.4mg/kg，染毒前配置;對(duì)照組為橄欖油）;注射容量為0.1ml/10g體重。
　　6.樣本收集
　　4種處理組中最后一個(gè)觀察終點(diǎn)(GD9)的孕鼠在孕9d經(jīng)脫臼

11、處死，取子宮、卵巢、肝、脾、腎和胚胎并稱重，計(jì)數(shù)胚胎植入數(shù)目;4種處理組中其他觀察終點(diǎn)的孕鼠在設(shè)計(jì)的觀察終點(diǎn)經(jīng)脫臼處死后取子宮組織，一半子宮組織經(jīng)手動(dòng)勻漿后取上清液，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。另一半子宮組織采用手工機(jī)械刮取法直接刮取孕鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞用于DNA損傷測(cè)定。
　　7.孕鼠子宮組織氧化應(yīng)激、DNA損傷、8-OH-dG和DNMT表達(dá)水平的測(cè)定
　　運(yùn)用考馬斯亮藍(lán)法對(duì)暴露組和對(duì)照組孕鼠子宮組織勻漿液進(jìn)行蛋白定量;運(yùn)用分光光度

12、法測(cè)定孕鼠子宮組織勻漿液中丙二醛(MDA)、過(guò)氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)和過(guò)氧化氫酶(CAT)水平;運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzymeslinkedimmunosorbentassay，ELISA)測(cè)定孕鼠子宮組織中8-OH-dG含量;應(yīng)用彗星實(shí)驗(yàn)(cometassay)檢測(cè)孕鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞DNA損傷水平;運(yùn)用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)(SDS-PAGE)和蛋白免疫印跡法(westernbl

13、otting)法測(cè)定孕鼠子宮組織中甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNAmethyltransferase1，DNMT1)含量。
　　8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　使用SPSS20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)，正態(tài)及近似正態(tài)分布的測(cè)量指標(biāo)均以(x)±s表示。首先對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn):若方差齊，則采用單因素方差分析(ONE-WAYANOVA)進(jìn)行F檢驗(yàn)，同時(shí)采用Dunnett'sttest進(jìn)行暴露組和對(duì)照組的比較;若方差不齊，則采用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)方法

14、（Kruskal-WallisH法）。并運(yùn)用相關(guān)分析分析各指標(biāo)間的關(guān)系。統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)水準(zhǔn)設(shè)定為α=0.05。
　　研究結(jié)果
　　1.圍植入期暴露于CS2對(duì)孕鼠母體及胚胎的毒性作用
　　母體毒性:孕鼠在胚胎植入不同時(shí)間點(diǎn)暴露于CS2后，孕鼠GD9體重和體重凈增量各暴露組與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);孕鼠子宮、卵巢、肝、脾以及腎等臟器的重量及臟器系數(shù)組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。說(shuō)明該暴露劑量

15、所致的母體毒性較小。
　　胚胎毒性:各暴露組胚胎植入數(shù)目均明顯低于對(duì)照組（P＜0.01）。GD3、GD4、GD5和GD6各暴露組的胚胎植入率分別為56.95％、36.26％、39.55％和52.74％，與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），暴露CS2后胚胎植入率明顯降低，GD4暴露組的胚胎植入率最低(P＜0.05)。在校正胚胎植入數(shù)目后胚胎均重與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2.圍植入期暴露于

16、CS2對(duì)孕鼠子宮組織氧化應(yīng)激的影響
　　CS2暴露后18h，各暴露組孕鼠子宮組織中MDA水平明顯升高，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），其中GD4暴露組孕鼠子宮組織MDA水平較對(duì)照組增高131.4％，GD3、GD5和GD6較對(duì)照組分別增高120.8％、121.6％和104.9％。此外，不同暴露時(shí)間點(diǎn)不同觀察終點(diǎn)孕鼠子宮組織中SOD、GSH-PX和CAT水平明顯降低，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01):CAT水

17、平在暴露后12h明顯降低(P＜0.01)，GSH-PX水平在暴露后12h和18h明顯降低(P＜0.01)，SOD水平在暴露后18h顯著降低（P＜0.01）。相關(guān)分析結(jié)果顯示，暴露后18h孕鼠子宮組織中MDA水平和GD9胚胎植入數(shù)目呈明顯負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.783，P＜0.01)。
　　3.圍植入期暴露于CS2對(duì)孕鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞DNA損傷的影響
　　孕鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞DNA損傷各項(xiàng)指標(biāo)（TL、TM、OTM和TDNA％）在CS2

18、暴露后6h時(shí)明顯升高(P＜0.01)，并在暴露后18h時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)（P＜0.01），之后各指標(biāo)值逐漸下降。相關(guān)分析結(jié)果顯示，CS2暴露后18h時(shí)孕鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞TM、OTM、TL和TDNA％與胚胎植入數(shù)目之間呈明顯負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.804、-0.847、-0.934和-0.863,P＜0.01)。
　　4.圍植入期暴露于CS2對(duì)孕鼠子宮組織8-OH-dG水平的影響
　　與對(duì)照組比較，孕鼠CS2暴露后18h和24h時(shí)孕鼠子

19、宮組織8-OH-dG水平顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。在18h和24h時(shí)孕鼠子宮組織8-OH-dG水平與對(duì)照組比較，分別升高893.8％和647.4％(P＜0.01)。
　　5.圍植入期暴露于CS2對(duì)孕鼠子宮組織DNMT1水平的影響
　　孕鼠在GD4暴露于CS2后6h時(shí)孕鼠子宮組織DNMT1表達(dá)水平明顯降低，而在暴露后12h時(shí)孕鼠子宮組織DNMT1表達(dá)水平明顯升高，與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01

20、)。相關(guān)分析結(jié)果顯示，CS2暴露后12h孕鼠子宮組織DNMT1表達(dá)水平與胚胎植入數(shù)目之間呈明顯負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.433，P＜0.01)。
　　6.氧化應(yīng)激、DNA損傷和8-OH-dG水平與CS2暴露的關(guān)系
　　孕鼠GD4暴露于CS2后DNA損傷各項(xiàng)指標(biāo)6h時(shí)出現(xiàn)明顯改變，而暴露于CS2后18h時(shí)子宮組織MDA升高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示CS2所致孕鼠子宮組織DNA損傷改變?cè)缬谘趸瘧?yīng)激變化。相關(guān)分析結(jié)果顯示，作為DNA氧化損傷

21、生物標(biāo)志物的8-OH-dG與DNA損傷指標(biāo)TDNA％、TL、TM和OTM之間呈正相關(guān)(r=0.766、0.688、0.738和0.771，P＜0.01)，且在氧化應(yīng)激最高點(diǎn)時(shí)子宮內(nèi)膜細(xì)胞DNA損傷程度達(dá)到高峰，提示氧化應(yīng)激引起的DNA氧化損傷進(jìn)一步加重孕鼠子宮組織的DNA損傷程度。
　　結(jié)論
　　1.圍植入期不同時(shí)間暴露于CS2均可導(dǎo)致孕鼠子宮組織發(fā)生明顯且短暫的氧化應(yīng)激反應(yīng)，呈現(xiàn)出明顯的時(shí)間變化規(guī)律且變化趨勢(shì)一致，與暴露時(shí)

22、點(diǎn)無(wú)關(guān)。
　　2.圍植入期暴露于CS2可導(dǎo)致孕鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞DNA損傷，并呈現(xiàn)出明顯的時(shí)間變化規(guī)律;氧化應(yīng)激通過(guò)引起DNA氧化損傷進(jìn)一步加重子宮內(nèi)膜細(xì)胞的DNA損傷程度。
　　3.子宮組織氧化應(yīng)激水平和內(nèi)膜細(xì)胞DNA損傷水平與CS2致胚胎植入障礙程度一致，兩者協(xié)同作用可能是CS2暴露致胚胎植入障礙的重要機(jī)制之一。
　　4.圍植入期暴露于CS2導(dǎo)致的子宮組織DNMT1表達(dá)水平的變化，可能與機(jī)體在氧化應(yīng)激和細(xì)胞DNA損傷毒