心肌細胞膜表面鈣離子通道在心房顫動時的表達水平及功能變化.pdf

1、心房顫動(Atrial Fibrillation，AF)是臨床上最為常見的心律失常，其主要表現(xiàn)為≥400次/分鐘的不規(guī)則電節(jié)律所引起的心房各部分快速顫動，它對人類健康的影響不容小覷。不論導致何種并發(fā)癥，AF均可顯著增加患者的致殘率和死亡率。它常伴有左心室收縮功能減退和充血性心力衰竭，還可以引起腦血管栓塞。AF可以惡化患者的生活質量，并消耗大量的醫(yī)療資源。但由于目前對于AF的發(fā)生機制尚不十分清楚，因此目前臨床上對AF的治療尚缺乏有效手段。

2、
　　鈣離子通道蛋白是一類由多種不同亞型構成的離子通道家族，廣泛存在于各種組織中，其作用涉及生長發(fā)育的調控、自律性的調節(jié)等多方面。在心肌細胞表面，目前已證實存在的鈣離子通道僅有T型及L型，參與了鈣穩(wěn)態(tài)的調控。研究發(fā)現(xiàn)，無論是臨床AF患者還是快速心房起搏(Rapid Atrial Pacing)誘發(fā)心房顫動的動物的心房肌細胞中，胞漿內游離鈣的水平均明顯升高，提示心肌細胞胞漿內鈣超負荷(Intracellular Calcium Ov

3、erloading)可能與AF的發(fā)生密切相關。
　　心肌細胞胞漿內的游離ca2+水平([Ca+]i)取決于兩個因素：一方面是出胞的Ca2+減少，如SERCA/PMCA系統(tǒng)及Na+-Ca2+/H+-Na+交換系統(tǒng)異常時，均可導致肌質網(wǎng)及細胞膜回攝及外排Ca2+減少，從而導致細胞內游離鈣水平增高；另一方面是入胞Ca2+增加，入胞的Ca2+有兩個來源，一是肌質網(wǎng)表面的鈣離子通道(蘭利堿受體，1，4，5-三磷酸肌醇受體)釋放Ca2+增加，

4、二是細胞膜表面的鈣離子通道(心肌表面為T型及L型鈣離子通道)介導的細胞外Ca2+入胞增加。
　　由于心房肌細胞膜表面的鈣離子通道(T型及L型鈣離子通道)是心房肌細胞胞漿內游離Ca2+的重要來源之一，因此，研究其在AF時表達和功能的改變對于揭示AF時細胞內鈣超負荷形成的機制及作用有著重要的意義。
　　本研究目的是采用多種技術手段研究AF時心房肌細胞膜表面鈣離子通道的表達及功能變化，以此闡述細胞膜鈣離子通道在AF時心房肌細胞胞漿

5、內鈣超負荷形成中的作用。標本是采自于接受開胸心臟手術患者的少量心房肌組織，按照基礎疾病類型和心律分組，借助于分子生物學及免疫組織化學方法比較了風濕性AF組患者、風濕性竇性心律患者和正常竇性心律患者之間T型和L型鈣離子通道的表達水平，并用激光共聚焦顯微鏡鈣成像技術比較了兩種鈣離子通道不同心律組患者中對Ca2+通量的影響。
　　第一部分心肌細胞膜表面鈣離子通道(T型及L型)在心房顫動及對照組心房肌組織中的表達差異
　　目的：研究

6、正常竇律(NSR)、風濕性瓣膜病竇律(RSR)及風濕性瓣膜病房顫(RAF)三組患者右房組織中L型鈣離子通道α1C和T型鈣離子通道α1G、α1H亞基mRNA豐度及蛋白定位和表達差異。
　　方法：術中獲取各組患者(NSR=10，RSR=11，RAF=16)少量右房標本，所有納入患者在建立體外循環(huán)后、灌注心肌停搏液前切取少量心房肌組織(約200mg～400mg)，于冰生理鹽水中洗凈血跡，分為兩部分，一部分(大小約200mg)剪切為小塊組

7、織后放入無RNA酶的凍存管中，迅速置入液氮中冷凍，隨后轉入-80℃深低溫冰箱保存；剩下組織放入10％中性福爾馬林溶液中固定，留作免疫組化染色用。提取總RNA，設計引物，實時熒光定量RT-PCR對各組α1C、α1G及α1H亞基的mRNA豐度相對定量(2-△△Ct法)；提取總蛋白，蛋白免疫印跡法比較三種α1亞基蛋白表達水平；HE染色及免疫組織化學染色比較三組標本的差異。
　　結果：與NSR及RSR組相比，RAF組的α1C及α1H的mR

8、NA豐度及蛋白水平顯著上調(P<0.05)，α1G表達水平三組間差異不顯著；三種α1亞基在NSR及RSR兩組間表達水平無顯著差異；HE染色及免疫組化染色發(fā)現(xiàn)RAF組較另外兩組間質增生明顯，核粗大，細胞膜表面通道蛋白重染，RSR組及NSR組則差異不明顯。
　　結論：房顫時，α1C及α1H亞基表達水平上調，而α1G亞基表達水平不變；風濕性因素對L及T型鈣離子通道的表達并無直接影響，但不能排除其對鈣離子通道功能發(fā)生影響的可能。
　

9、　第二部分心肌細胞膜表面鈣離子通道(T型及L型)在心房顫動組及對照組中的功能差異
　　目的：1、在分離人單個心房肌細胞的經(jīng)典方法基礎上，探索適合本中心所獲得的心房顫動患者心房肌組織的心肌細胞分離方法；
　　2、在分離獲得的單個心房肌細胞基礎上，借助于激光共聚焦熒光倒置顯微鏡及鈣成像技術，觀察心房顫動組及竇率組不同鈣離子通道激活前后胞漿內游離Ca2+水平的改變；
　　3、探索成人心房肌活組織切片制備及培養(yǎng)方法，建立一種保

10、留心肌完整結構的多細胞電生理研究模型，為下一步電生理研究作準備。
　　方法：1、改良Bustamante法急性分離成人單個心房肌細胞：所有納入患者在建立體外循環(huán)后、灌注心肌停搏液前切取少量心房肌組織，立即保存于37℃氧飽和的無鈣液中，并在5～10min內轉運至實驗室；將標本切成細小的組織塊(<2mm3)，在36～37℃下以氧飽和的無鈣液沖洗3次；將組織塊在含有膠原酶I(0.4m/ml)和蛋白酶XXIV(0.2mg/ml)的無鈣液中

11、孵育20～30min，37℃下持續(xù)充氧，磁力攪拌器4Hz頻率持續(xù)攪拌；用無鈣液沖洗1min；將組織塊在含有膠原酶I(0.4 mg/ml)的無鈣液中孵育，37℃下持續(xù)充氧，磁力攪拌器4Hz頻率持續(xù)攪拌，每10min鏡下觀測一次，直至出現(xiàn)單個心肌細胞；將組織塊放入KB液中輕輕吹打，所獲得的細胞懸液以200目濾網(wǎng)過濾，KB液保存；取KB液保存30～60min的心肌懸液，吹勻，經(jīng)200目濾網(wǎng)過濾，1000 r/min離心5 min，棄上清，按由

12、低到高梯度復鈣至1.5mmol/L，吹勻后加入培養(yǎng)皿中，于倒置顯微鏡下觀察。加入臺盼藍(4g/L臺盼藍1份+9份細胞懸液，放置3min)，血球計數(shù)板分別計數(shù)活細胞及死細胞數(shù)。
　　2、激光共聚焦熒光倒置顯微鏡觀察T型及L型鈣離子通道對Ca2+的通量在房顫組及竇律組的差異：分離獲得AF組及對照組單個心房肌細胞，在細胞懸液中加入Thapsigargin(TG，毒胡蘿卜內酯)以耗竭肌質網(wǎng)內的儲備鈣，終濃度1μmol/L，放置10min后

13、，用無鈣液洗凈：將每例標本所獲取的存活心肌細胞懸液分為兩份，滴入激光掃描共聚焦熒光顯微鏡專用培養(yǎng)皿中放置半小時，讓其自然貼壁。在培養(yǎng)皿中加入熒光染料Fluo-4/AM(終濃度20μmol/L)，孵育30min，用無鈣液洗凈細胞膜表面染料，然后細胞外液換用1mmol/L的含鈣液，在其中一份的培養(yǎng)皿中加入L型鈣通道阻斷劑Verapamil(終濃度10μmol/L)，另一份加入T型鈣通道阻斷劑Mibefradil(終濃度1μmol/L)，分別

14、孵育20min；在LSCFM下，用氪氬離子激光激發(fā)(激發(fā)波長494nm，發(fā)射波長516nm)，觀察并記錄鈣離子通道靜息狀態(tài)下人心房肌細胞內游離Ca2+的熒光強度(OD1)；在培養(yǎng)皿中加入40mmol/L KCl溶液，使細胞膜除極化，激活未被阻斷的鈣離子通道，記錄鈣離子通道激活后心肌細胞內游離Ca2+的熒光強度(OD2)；將所測得的激活后細胞內熒光強度除以靜息狀態(tài)下的細胞內熒光強度(OD2/OD1)，所得即為統(tǒng)計量。組間t檢驗比較兩組熒光

15、強度比值。
　　3、探索成人心房肌活組織切片制備及培養(yǎng)方法：所有納入患者在建立體外循環(huán)后、灌注心肌停搏液前切取少量心房肌組織，立即保存于37℃氧飽和的無鈣液中，并在5～10min內轉運至實驗室；在標本到達之前，將低熔點瓊脂糖粉在70℃水浴下用超純水溶解成液體(濃度4％)，然后保存于45℃水浴中：標本運到后用冷無鈣液沖洗干凈血跡；將組織塊放入標本固定槽中，將液態(tài)的瓊脂糖溶液倒入槽中，使其沒過組織塊，并立即在標本固定槽外周放置冰屑，讓

16、裝置快速冷卻，使瓊脂糖溶液在極短的時間內凝固并將心房肌組織塊包埋其中；小心切除多余瓊脂，保留含有心房肌組織的部分：安裝好自動組織振動切片機的工作槽及刀片，在槽外填入冰屑，槽內加入無鈣液的冰水混合物；用快速黏合劑將包埋有心房肌組織的瓊脂糖塊固定在物臺上，放入切片機內切片，切片厚度為150μm～300μm；將獲得的心房肌組織切片4℃下放入含鈣液中梯度復鈣共計30min，液體持續(xù)用100％O2飽和；將復鈣后的心房肌組織切片移入高糖DMEM細胞

17、培養(yǎng)液中，37℃水浴下孵育30min，持續(xù)用5％CO2+95％O2混合氣體飽和液體；孵育后的心肌組織切片放入紅外倒置相差顯微鏡載物臺的灌流槽中觀察，灌流槽中為100％O2飽和的含鈣液(1mmol/L)。
　　結果：1、采用改良的Bustamante兩步酶消化法，可以分離獲得形態(tài)呈桿狀、橫紋清晰、細胞膜完整的具有典型特征的單個人心房肌細胞。復鈣后，倒置顯微鏡下觀察可見部分細胞恢復自主收縮活動，完全貼壁后收縮消失，形態(tài)無明顯變化。經(jīng)臺

18、盼藍染色后，死細胞被染成淡藍色，活細胞拒染，細胞存活率約在20％～50％；
　　2、阻滯L型鈣通道后，NSR組細胞激動前后OD比值(OD2/OD1)低于RAF組(1.38±0.20 vs1.88±0.32)，阻滯T型鈣通道后，NSR組細胞激動前后細胞內鈣水平的升高亦低于RAF組(1.43±0.24 vs2.48±0.40)。通過比較各組在阻斷不同鈣離子通道后所得的OD比值發(fā)現(xiàn)，在NSR組中，阻斷兩種鈣離子通道對細胞內鈣離子水平的影

19、響相當，而在RAF組中，阻斷T型鈣通道對細胞內鈣離子水平的影響要大于阻斷L型鈣通道；
　　3、采用本方法制備所得成人心肌活組織切片心態(tài)良好，橫紋清晰，間質及閏盤結構清楚，復鈣后可見自發(fā)性搏動。
　　結論：1、利用改良Bustamante兩步酶消化法能夠成功分離獲得形態(tài)學良好單個人心房肌細胞；
　　2、RAF組對比NSR組，其T型鈣通道和L型鈣通道的鈣通量均明顯增加，提示其可能參與了心肌細胞內鈣超負荷的形成；AF發(fā)生后，

20、L型鈣通道鈣通量的增加明顯高于T型鈣通道鈣通量的增加，提示L型鈣通道在AF時心肌細胞內鈣超負荷形成中所起的作用較T型鈣通道更大；
　　3、采用低熔點瓊脂糖包埋及自動組織振動切片機切片培養(yǎng)的方法，能夠獲得形態(tài)良好、具有正常機械活動的心肌活組織切片。
　　創(chuàng)新點：
　　1.首次研究了T型鈣離子通道的兩個亞型(α1G、α1H)在風濕房顫、風濕竇律及正常竇律患者心房組織中的mRNA豐度及蛋白表達水平，并發(fā)現(xiàn)L型鈣離子通道(α1