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1、目的:克隆少汗型外胚層發(fā)育不良癥eda-A1基因并進(jìn)行突變分析,同時(shí)構(gòu)建eda-A1基因編碼序列(CDS)突變型(M)和野生型(W)的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)-eda-A1-M/W,轉(zhuǎn)染臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(ECV),觀察細(xì)胞周期的變化,以進(jìn)行eda基因功能研究。 方法:設(shè)計(jì)含有BamHⅠ和HindⅢ的酶切位點(diǎn)的引物,從HED患者和正常對(duì)照者外周血淋巴細(xì)胞中提取總mRNA,利用RT-PCR法克隆eda-A1(M/W)基因cD
2、NA序列;運(yùn)用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切pcDNA3.1(-)載體和eda-A1(M/W)基因片段,將eda-A1(M/W)插入到pcDNA3.1(-)載體中,從而構(gòu)建新的真核表達(dá)載體,命名為pcDNA3.1(-)-eda-A1-M和pcDNA3.1(-)-eda.A1-W,重組載體PCR、雙酶切、DNA測(cè)序分析;重組載體轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(ECV),進(jìn)行eda基因超表達(dá),以分析eda基因?qū)?xì)胞功能的影響。 結(jié)果:克隆少汗型
3、外胚層發(fā)育不良癥eda-A1基因并發(fā)現(xiàn)未見報(bào)道過(guò)的907位A→C(A907C)錯(cuò)義突變,導(dǎo)致306位編碼氨基酸由谷氨酰胺變異為脯氨酸(Gln306→Pro);經(jīng)PCR、雙酶切驗(yàn)證,成功構(gòu)建了pcDNA3.1(-)-eda-A1-W/M的真核表達(dá)載體;流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示:1)與空質(zhì)粒組(對(duì)照組,C)組相比,野生型(Wlid,W)組S細(xì)胞增多,G2/M期細(xì)胞明顯減少(P<0.01);突變體(Mutant,M)組中有更多細(xì)胞進(jìn)入G0/G1期,
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