針對survivin基因hnRNA和mRNA的RNAi實驗研究.pdf

1、[目的]：
　　根據(jù)RNAi原理，構(gòu)建針對survivin基因內(nèi)含子序列和外顯子序列的重組干擾質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平檢測兩類質(zhì)粒對survivin的抑制效果，并了解其對細(xì)胞凋亡的影響。探索RNAi與mRNA前體、成熟mRNA之間的關(guān)系以及RNA干擾對轉(zhuǎn)錄過程的影響機(jī)制。
　　[方法]：
　　遵循RNA干擾設(shè)計的原則，設(shè)計并構(gòu)建針對內(nèi)含子4個靶點的pGP/U6/GFP/neo-survivin

2、 shRNA重組干擾質(zhì)粒，并設(shè)置一個無關(guān)序列組即陰性對照組，2個針對survivin基因外顯子序列的重組干擾質(zhì)粒，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組干擾質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)至HeLa細(xì)胞。運用實時熒光定量PCR相對定量檢測survivinmRNA的表達(dá)水平，篩選出抑制效果較好的質(zhì)粒，用Western Blot檢測Survivin蛋白表達(dá)水平。并且通過AnnexinⅤ-FITC和PI雙染色法、Hoechst33258染色了解RNAi對HeLa細(xì)胞凋亡的影響。

3、r>　　[結(jié)果]：
　　成功構(gòu)建了針對survivin內(nèi)含子和外顯子序列的重組干擾質(zhì)粒pGP/U6/GFP/neo-survivin shRNA。轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后，與陰性對照組和空白組比較，實驗組的survivin mRNA均被有效抑制，均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，其中轉(zhuǎn)染pGP/U6/GFP/neo-survivin-shRNA-4重組質(zhì)粒組的干擾效果更好。并且Survivin蛋白也隨之減少。熒光顯微鏡觀察HeLa細(xì)胞的

4、凋亡，實驗組明顯多于陰性對照組和空白組。流式細(xì)胞術(shù)測得HeLa細(xì)胞的凋亡率，實驗組與空白組相比有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。
　　[結(jié)論]：
　　針對survivin內(nèi)含子和外顯子序列的重組干擾質(zhì)粒均可以使HeLa細(xì)胞中的survivin mRNA和蛋白水平明顯下降，實驗組細(xì)胞凋亡明顯。說明RNAi對成熟或未成熟mRNA均具有干擾作用，都能影響細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，并且針對survivin基因內(nèi)含子的干擾重組質(zhì)?？赡芨蓴_效果更好。