低溫低氧對學(xué)習(xí)記憶的影響及藥物防護(hù)研究.pdf

1、我國高原面積廣闊,具有重要軍事及經(jīng)濟(jì)意義的青藏高原平均海拔在4000米以上?？諝庀”　⒌蜏馗稍锏忍厥獾母咴h(huán)境對進(jìn)入人群的身心健康產(chǎn)生嚴(yán)重威脅。大腦對低溫、低氧刺激尤為敏感,以腦水腫為病理基礎(chǔ)的急性高原病在以往得到了廣泛研究。近年來,高原低氧環(huán)境引起的記憶能力下降,反應(yīng)速度下降,錯(cuò)誤判斷增加和感覺異常等認(rèn)知能力損傷成為特殊環(huán)境醫(yī)學(xué)關(guān)注的焦點(diǎn)。認(rèn)知能力的損傷嚴(yán)重影響高原地區(qū)官兵與居民的作業(yè)效能與生命健康,如何防護(hù)高原低氧環(huán)境引起的學(xué)習(xí)記憶

2、能力下降成為亟待解決的重要問題。目前高原低溫低氧損傷學(xué)習(xí)記憶的特點(diǎn)與醫(yī)學(xué)防護(hù)研究仍處于起步階段,有關(guān)高原環(huán)境損傷學(xué)習(xí)記憶的相關(guān)基礎(chǔ)與應(yīng)用研究主要集中在動(dòng)物模型水平,人群研究主要為模擬環(huán)境下的實(shí)驗(yàn)室研究,并不能有效反應(yīng)現(xiàn)實(shí)條件下的暴露情況及生物學(xué)效應(yīng)。此外,現(xiàn)有研究往往只關(guān)注低壓低氧單一因素對認(rèn)知功能產(chǎn)生的影響,而忽略了高原地環(huán)境區(qū)的另一主要因素——環(huán)境低溫,高原低溫低氧復(fù)合環(huán)境對認(rèn)知功能造成的影響有待探討。在藥物防護(hù)方面,神經(jīng)興奮藥物與

3、激素類藥物如安非他命、地塞米松等對高原低氧認(rèn)知功能損傷具有一定的保護(hù)作用,但由于其副作用較大,無法作為常規(guī)預(yù)防藥物。最近的研究發(fā)現(xiàn),中藥銀杏葉的多種成分對腦功能具有良好的保護(hù)作用,其標(biāo)準(zhǔn)提取物 EGb-761能夠調(diào)節(jié)腦血流,降低氧化損傷,并被認(rèn)為具有促進(jìn)高原習(xí)服的作用。乙酰唑胺作為預(yù)防急性高原反應(yīng)(AMS)的首選藥物,能夠加快機(jī)體低氧適應(yīng)。但銀杏葉提取物EGb-761及乙酰唑胺對高原認(rèn)知損傷的預(yù)防作用尚不明確。因此,乙酰唑胺及銀杏葉提取

4、物EGb-761對高原低溫低氧記憶損傷的預(yù)防效果及作用機(jī)制有待證實(shí)。
　　目的：
　　通過人群現(xiàn)場研究及動(dòng)物模型研究,觀察高原低溫低氧復(fù)合環(huán)境對學(xué)習(xí)記憶能力的影響,初步評價(jià)乙酰唑胺及銀杏葉提取物 EGb-761對急進(jìn)高原人群學(xué)習(xí)記憶能力的影響,探討銀杏葉提取物活性成分單體銀杏內(nèi)酯 B(GKB)對小鼠低溫低氧暴露學(xué)習(xí)記憶損傷的防護(hù)作用,闡明GluR1蛋白磷酸化水平在GKB防護(hù)低溫低氧學(xué)習(xí)記憶能力損傷中的作用,為急進(jìn)高原引起的學(xué)

5、習(xí)記憶損傷藥物防護(hù)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.受試者分組、藥物干預(yù)及試驗(yàn)流程
　　招募年齡17至20歲的男性志愿者進(jìn)行人群現(xiàn)場研究,隨機(jī)分為兩組,在夏季與冬季分別進(jìn)行研究。每組按藥物干預(yù)不同隨機(jī)分為乙酰唑胺組(125 mg BID)、銀杏葉組(120 mg BID)和安慰劑組。藥物干預(yù)在進(jìn)入高原前3天開始,共持續(xù)4天。研究對象乘飛機(jī)在3小時(shí)內(nèi)從海拔396 m上升到海拔3658 m。試驗(yàn)地點(diǎn)為西藏拉薩市

6、,平均氣溫為:夏季18-21℃,冬季0-3℃。
　　2.受試者記憶能力評價(jià)
　　利用記憶能力測試評價(jià)受試者在夏季及冬季急進(jìn)高原前后記憶水平的變化情況。主要測試包括瞬時(shí)回憶測試(瞬時(shí)單詞回憶測試、瞬時(shí)圖形回憶測試)、定速視覺相加測試(Paced visual serial addition test,PVSAT)、數(shù)符轉(zhuǎn)換測試(Digital symbol substitution test,DSST)和延遲回憶測試(延遲單詞

7、回憶測試、延遲圖形回憶測試)。
　　3.受試者AMS發(fā)病情況
　　利用Lake Louise評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評價(jià),其中Lake Louise評分標(biāo)準(zhǔn)包括自我評分(Self-reported score,S-LLS)和臨床評分(Clinical assessment score,C-LLS)兩部分。
　　4.低溫低氧暴露模型建立
　　雄性C57J小鼠(18-24 g)經(jīng)不同海拔低溫低氧暴露后,以5000m/4℃暴露2

8、h為暴露條件建立低溫低氧暴露模型。動(dòng)物隨機(jī)分為對照組、GKB預(yù)處理組、低溫低氧暴露組和GKB預(yù)處理低溫低氧暴露組。GKB通過腹腔注射方式于暴露開始前1 h給藥,劑量為40mg/kg?body weight。
　　5.低溫低氧暴露小鼠學(xué)習(xí)記憶測試
　　通過新物體識別測試(Novel object recognition test)及回避離開平臺(tái)實(shí)驗(yàn)(Step-dwon inhibitory avoidance task)觀察小

9、鼠短期記憶與工作記憶能力。主要觀察小鼠在新物體識別實(shí)驗(yàn)中對新物體的探索時(shí)間與鑒別指數(shù)(DI)及回避離開平臺(tái)實(shí)驗(yàn)中小鼠離開平臺(tái)的潛伏期。
　　6.低溫低氧暴露小鼠記憶相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測
　　通過western blot方法檢測NMDA、GluR1、Akt、GSK、PKC等蛋白的表達(dá)與活化水平。
　　7.低溫低氧暴露小鼠海馬蛋白激酶A(PKA)活性的檢測
　　通過ELISA試劑盒方法檢測小鼠海馬組織PKA活性水平。<

10、br>　　結(jié)果：
　　1.低氧環(huán)境對學(xué)習(xí)記憶的影響及藥物的防護(hù)效果
　　(1)低氧環(huán)境對各組AMS發(fā)生情況的影響
　　各組受試對象在高原停留期間均有AMS發(fā)生,乙酰唑胺組S-LLS評分(1.5)顯著低于安慰劑組(3.0)和銀杏葉組(2.8)(p<0.05)。
　　(2)低氧環(huán)境對學(xué)習(xí)記憶的影響
　　各組學(xué)習(xí)測試成績在急進(jìn)高原后與平原水平相比均呈現(xiàn)下降趨勢,并以急進(jìn)高原后8 h最為顯著(p<0.05)。

11、>　　(3)乙酰唑胺對低氧環(huán)境學(xué)習(xí)記憶能力的影響
　　在高原3天的測試中,乙酰唑胺組在DSST、PVSAT及延遲回憶測試中的成績顯著低于安慰劑組(p<0.05),通過對急進(jìn)高原8h后測試成績的進(jìn)一步比較后我們發(fā)現(xiàn),乙酰唑胺組在瞬時(shí)回憶及PVSAT測試中的成績顯著低于安慰劑組(p<0.05)。
　　(4)銀杏葉對低氧環(huán)境學(xué)習(xí)記憶能力的影響
　　在高原3天的測試中,銀杏葉組在DSST、PVSAT及延遲回憶測試中的成績顯著高

12、于安慰劑組(p<0.05)。通過對急進(jìn)高原8h后測試成績的進(jìn)一步比較后我們發(fā)現(xiàn),銀杏葉組受試對象在延遲回憶測試中的成績顯著高于安慰劑組(p<0.05)。
　　(5)AMS對學(xué)習(xí)記憶的影響
　　各藥物干預(yù)組中發(fā)生AMS的受試對象測試成績與未發(fā)生 AMS的受試對象相比無顯著差別。
　　2.低溫低氧復(fù)合環(huán)境對學(xué)習(xí)記憶的影響及藥物的防護(hù)效果
　　(1)低溫低氧復(fù)合環(huán)境對AMS發(fā)生情況的影響
　　各組受試對象在高原停

13、留期間均有AMS發(fā)生,乙酰唑胺組S-LLS評分(2.2)顯著低于安慰劑組(3.9)和銀杏葉組(3.3)(p<0.05)。
　　(2)低溫低氧復(fù)合環(huán)境對學(xué)習(xí)記憶的影響
　　各組學(xué)習(xí)測試成績在急進(jìn)高原后與平原水平相比均呈現(xiàn)下降趨勢,并以急進(jìn)高原后8 h最為顯著(p<0.05)。
　　(3)乙酰唑胺對低溫低氧復(fù)合環(huán)境學(xué)習(xí)記憶能力的影響
　　在高原3天的測試中,乙酰唑胺組在 PVSAT測試中的成績顯著低于安慰劑組(p<0

14、.05),通過對急進(jìn)高原8h后測試成績的進(jìn)一步比較后我們發(fā)現(xiàn),乙酰唑胺組受試對象在DSST及PVSAT測試中的成績顯著低于安慰劑組(p<0.05)。
　　(4)銀杏葉對低溫低氧復(fù)合環(huán)境學(xué)習(xí)記憶能力的影響
　　在高原3天的測試中,銀杏葉組受試對象在PVSAT及延遲回憶測試中的成績顯著高于安慰劑組(p<0.05)。通過對急進(jìn)高原8 h后測試成績的進(jìn)一步比較后我們發(fā)現(xiàn),銀杏葉組在延遲回憶測試中顯著高于安慰劑組(p<0.05)。

15、r>　　(5)AMS對學(xué)習(xí)記憶能力的影響
　　各藥物干預(yù)組中發(fā)生AMS的受試對象測試成績與未發(fā)生 AMS的受試對象相比無顯著差別。
　　(6)低溫低氧復(fù)合環(huán)境與低氧環(huán)境學(xué)習(xí)記憶能力的比較
　　通過對夏季和冬季兩組急進(jìn)高原人群安慰劑組測試成績的比較后發(fā)現(xiàn),冬季低溫低氧暴露組在瞬時(shí)/延時(shí)回憶、DSST和PVSAT測試中的成績顯著低于夏季低氧暴露組(p<0.05)。
　　3. GKB在低溫低氧損傷學(xué)習(xí)記憶中的作用及機(jī)制

16、
　　(1)低溫低氧暴露對小鼠記憶能力的影響
　　在新物體識別測試和回避離開平臺(tái)測試中我們發(fā)現(xiàn),在新物體識別測試中,5000 m海拔暴露組小鼠與對照組相比,對新物體的探索時(shí)間及鑒別指數(shù)(DI)顯著降低(p<0.05);在回避離開平臺(tái)測試中,5000 m海拔暴露組小鼠與對照組相比,離開平臺(tái)的潛伏期顯著縮短(p<0.05)。
　　(2)GKB對低溫低氧暴露損傷小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響
　　在新物體識別測試中,GKB能夠顯著

17、提高低溫低氧暴露后小鼠對新物體的探索時(shí)間(p<0.05)及鑒別指數(shù)(DI)(p<0.05)。GKB注射組小鼠在回避離開平臺(tái)測試中離開平臺(tái)的潛伏期顯著多于生理鹽水注射低溫低氧暴露組(p<0.05)。
　　(3)低溫低氧暴露及GKB干預(yù)對學(xué)習(xí)記憶相關(guān)蛋白的影響
　　通過western blot檢測我們發(fā)現(xiàn)小鼠海馬組織Akt、GSK-3β、Erk的磷酸化水平及 PKCα/β、NMDA的表達(dá)水平在低溫低氧暴露后無明顯變化趨勢,而 G

18、luR1蛋白ser831/845位點(diǎn)磷酸化水平及PKA活性在暴露后顯著低于對照組(p<0.05)。
　　GKB能夠緩解低溫低氧暴露引起的GluR1蛋白磷酸化水平及PKA活性的下降,在低溫低氧暴露后,GKB組 GluR1蛋白ser831/845位點(diǎn)磷酸化水平及PKA活性顯著高于生理鹽水組(p<0.05)。
　　結(jié)論：
　　本研究通過人群現(xiàn)場研究發(fā)現(xiàn)急進(jìn)高原能夠引起學(xué)習(xí)記憶能力下降,而環(huán)境低溫能夠顯著加重這種損傷效應(yīng)。乙酰