早期針刺對(duì)缺血缺氧后幼鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響.pdf

1、新生兒窒息是圍產(chǎn)期醫(yī)學(xué)的重要課題。窒息產(chǎn)生的低氧血癥和酸中毒常導(dǎo)致多臟器損害，其中缺氧缺血性腦?。℉ypoxic-IschemicBrainDamage，HIBD)是窒息后腦損傷死亡和傷殘的最常見原因。隨著新生兒重癥監(jiān)護(hù)的廣泛開展，窒息的搶救成功率在逐年提高，缺氧缺血性腦病患兒亦隨之相應(yīng)增加，25﹪的存活兒可呈現(xiàn)永久性腦損害如腦癱、癲癇、智力低下、學(xué)習(xí)困難及視聽障礙等臨床后遺癥。發(fā)展中國(guó)家HIBD發(fā)病率為3-12﹪，傷殘率及死亡率可高達(dá)

2、30﹪。據(jù)報(bào)道在孟加拉國(guó)死產(chǎn)胎兒中有15-20﹪是由HIBD所致；在我國(guó)則有7﹪-10﹪(140-200萬(wàn))的新生兒發(fā)病，其中約1/3的窒息兒死亡，30萬(wàn)左右的窒息兒出現(xiàn)不同程度的殘疾。對(duì)此疾病目前臨床尚無(wú)統(tǒng)一、有力、完整的治療方案，特別是缺乏針對(duì)遠(yuǎn)期有肯定療效的有效措施。 研究表明，針刺可改善各種原因所造成的認(rèn)知障礙，包括老年性癡呆、血管性癡呆及糖尿病性癡呆等等。有報(bào)道稱，早期給予穴位注射可促進(jìn)患兒智力發(fā)育，降低腦癱的發(fā)生。電

3、針圍產(chǎn)期缺血缺氧性腦損傷大鼠的“百會(huì)”穴，可通過影響海馬fos蛋白的表達(dá)，從而提高新生鼠遠(yuǎn)期空間學(xué)習(xí)記憶能力。目前，以針刺為主的綜合療法是臨床治療小兒腦性疾病的最為常用的方法，但至今為止，所得結(jié)果多為臨床證據(jù)，又總因選擇其病理過程的時(shí)期不同或病變已不可逆轉(zhuǎn)，或功能不足代償?shù)龋怪嬖诏煶涕L(zhǎng)而療效不穩(wěn)定、相當(dāng)部分病例療效差等問題。本研究擬模擬圍產(chǎn)期窒息建立HIBD模型，并觀察早期針刺干預(yù)對(duì)其學(xué)習(xí)記憶能力的影響及其作用機(jī)制，著重研究針刺對(duì)海

4、馬突觸可塑性的影響、對(duì)海馬興奮性和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)釋放的影響，以及對(duì)海馬興奮性和抑制性神經(jīng)細(xì)胞功能的影響及相互關(guān)系，為進(jìn)一步研究其分子機(jī)制打下基礎(chǔ)，為闡述針刺治療HIBD的機(jī)理提供新的科學(xué)資料，為推廣早期針刺改善新生兒學(xué)習(xí)記憶能力、提高針灸臨床療效提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 本實(shí)驗(yàn)分為兩部分，首先模擬圍產(chǎn)期窒息建立HIBD模型，利用Morris水迷宮和海馬腦片長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)效應(yīng)(LTP)的記錄從整體和細(xì)胞水平來評(píng)價(jià)模型的學(xué)習(xí)記憶能力和針刺的治療作

5、用；隨后利用免疫組織化學(xué)方法觀察針刺對(duì)HIBD學(xué)習(xí)記憶障礙動(dòng)物海馬Glu和GABA表達(dá)的影響，利用腦片膜片鉗全細(xì)胞記錄觀察HIBD是否導(dǎo)致海馬興奮性神經(jīng)元和抑制性神經(jīng)元的功能受損以及針刺是否可以對(duì)抗此效應(yīng)，以探討HIBD學(xué)習(xí)記憶障礙的可能機(jī)理和針刺改善HIBD學(xué)習(xí)記憶障礙的可能機(jī)制。 1缺血缺氧對(duì)幼鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及針刺的治療作用1.1實(shí)驗(yàn)方法1.1.1模擬圍產(chǎn)期窒息制備HIBD模型實(shí)驗(yàn)用健康雌性Wistar大鼠，孕16天，

6、待其自然分娩，使用乳鼠102只。隨機(jī)分為正常對(duì)照組(Con)，缺血缺氧組(HIBD)，缺血缺氧+針刺組(HIBD+ACU)即針刺治療組，為避免系統(tǒng)誤差，每窩乳鼠三組均有入選。 在室溫22℃左右條件下，將出生后1小時(shí)左右的乳鼠放入50ml廣口瓶中，用橡皮塞塞緊，保持1小時(shí)。模型制作完畢后，仍將乳鼠放回母鼠所在籠中，與其它乳鼠共同喂養(yǎng)。 1.1.2針刺治療時(shí)間和選穴出生后第8天開始針刺治療。根據(jù)臨床文獻(xiàn)報(bào)道選臨床常用的穴位。

7、選穴原則從調(diào)督脈入手，因督脈為陽(yáng)脈之海，總督一身之陽(yáng)。刺激督脈，可振奮一身之陽(yáng)，促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育；督脈絡(luò)腎入腦，刺督脈可補(bǔ)髓益腦，改善智力。選取督脈的“百會(huì)”、“大椎”。手針治療，留針20min，1次/天，共治療10次，觀察針刺的治療作用。其余組別動(dòng)物除不進(jìn)行針刺處理外，其余處理均同針刺組。 1.1.3Morris水迷宮測(cè)試動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力出生后30天進(jìn)行行為學(xué)測(cè)定。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程分為隱藏平臺(tái)獲得實(shí)驗(yàn)和空間搜索實(shí)驗(yàn)兩部分。 隱

8、藏平臺(tái)獲得實(shí)驗(yàn)：用于測(cè)量動(dòng)物在水迷宮中的學(xué)習(xí)和記憶能力。實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物自由游泳2min。正式實(shí)驗(yàn)每天訓(xùn)練4次，每次180s，隨機(jī)從東、西、南、北四個(gè)入水點(diǎn)選擇一個(gè)，將動(dòng)物面向池壁放入水中，記錄動(dòng)物尋找并爬上平臺(tái)所需時(shí)間即逃避潛伏期(escapelatency)。實(shí)驗(yàn)歷時(shí)7天。計(jì)算每天各組動(dòng)物4次逃避潛伏期的平均值。 空間搜索實(shí)驗(yàn)：用于測(cè)量動(dòng)物對(duì)平臺(tái)空間位置準(zhǔn)確記憶，即記憶保持能力。第8天撤除平臺(tái)，任選一個(gè)入水點(diǎn)將動(dòng)物放入水中，動(dòng)物在

9、水中游泳180s。測(cè)量180s內(nèi)：(1)動(dòng)物在目標(biāo)象限(原平臺(tái)所在象限)(targetquadrant)和其他各象限的游泳時(shí)間；(2)動(dòng)物在目標(biāo)象限和其他各象限游泳路徑的長(zhǎng)短。 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，組間差異采用ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。1.1.4蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色方法 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)海馬進(jìn)行HE染色觀察其CA1區(qū)細(xì)胞分布情況。采用腹腔注射1﹪戊巴比

10、妥鈉(40mg/Kg)麻醉后，常規(guī)心臟灌流固定，取腦，4℃冰箱過夜至組織塊沉底。對(duì)端腦做額狀面冰凍切片，片厚30μm。染色結(jié)果：細(xì)胞核藍(lán)染至深藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)、膠原纖維、肌纖維及嗜酸性顆粒呈粉紅色或淺紅色，兩色對(duì)比鮮明。普通光學(xué)顯微鏡下觀察各組動(dòng)物海馬CA1區(qū)的細(xì)胞分布情況。 1.1.5海馬腦片長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)效應(yīng)(LTP)的誘發(fā)和記錄行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將幼鼠直接斷頭取腦，振動(dòng)切片機(jī)將組織冠狀面切片，片厚450μm，然后將腦片移入含有飽和

11、混合氣(95﹪O2+CO2﹪)的人工腦脊液(ACSF)，分離海馬，孵育一小時(shí)后，移入浴槽進(jìn)行記錄。將刺激電極置于由CA3發(fā)出的Schaffer側(cè)枝路徑上，由電刺激器產(chǎn)生單刺激。記錄電極置于CA1錐體細(xì)胞層，深度50-100μm，誘發(fā)電位經(jīng)微電極放大器和前置放大后顯示在示波器上，經(jīng)Axon數(shù)據(jù)采集卡，將信號(hào)轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)，由Axoscope8.0軟件記錄。 在記錄誘發(fā)群峰電位的基礎(chǔ)上，先觀察10-15min的單刺激誘發(fā)反應(yīng)，待記錄

12、穩(wěn)定后，用高頻串刺激(100串100Hz的強(qiáng)直刺激)誘發(fā)LTP。記錄海馬腦片高頻刺激后1h內(nèi)LTP的變化。計(jì)算其斜率變化和波幅變化。 對(duì)每組動(dòng)物海馬受到高頻刺激后60min的不同時(shí)間點(diǎn)LTP變化(與刺激前比較)的斜率和波幅的百分比進(jìn)行比較，采用one-wayANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 1.2結(jié)果1.2.1模型觀察缺氧10min新生鼠煩躁不安；缺氧15～20min所有大鼠出現(xiàn)紫紺，呼吸加深加快：20～30min新生鼠躁動(dòng)劇

13、烈，拼命直立，將頭部伸向瓶口處，出現(xiàn)喘呼吸；35～60min乳鼠活動(dòng)明顯減少，很少變換姿勢(shì)，紫紺更加明顯，呈黑紫色。出生時(shí)各組動(dòng)物體重?zé)o明顯差異(P＞0.05)。一個(gè)月后，動(dòng)物的體重均有所增加，但HIBD組幼鼠的體重增長(zhǎng)明顯落后于正常對(duì)照組(P＜0.01)。 1.2.2Morris水迷宮學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)試結(jié)果Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。隱藏平臺(tái)獲得實(shí)驗(yàn)進(jìn)行7天，各組動(dòng)物的逃避潛伏期均隨游泳次數(shù)增多而減小，波形呈

14、鋸齒狀，說明動(dòng)物對(duì)前次的學(xué)習(xí)有遺忘。HIBD幼鼠的平均潛伏期明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.05)，針刺后有明顯好轉(zhuǎn)。 第8天撤掉目標(biāo)象限的臺(tái)子，進(jìn)行空間搜索實(shí)驗(yàn)，計(jì)算大鼠在目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比和所游距離的百分比，用來檢測(cè)記憶保持能力。結(jié)果顯示正常和針刺兩組幼鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡主要集中在原平臺(tái)附近，而HIBD幼鼠則多沿池壁游泳，運(yùn)動(dòng)軌跡雜亂無(wú)章。HIBD組動(dòng)物在目標(biāo)象限停留的時(shí)間百分比最短(29.44±4.05﹪)，游泳的距離百分比也最