Stat5徑路調(diào)控膽鹽轉(zhuǎn)運(yùn)子Ntcp和Bsep表達(dá)及促膽鹽轉(zhuǎn)運(yùn)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景： 膽酸(鹽)是肝臟分泌到膽汁中最大量的有機(jī)酸，是膽汁的主要成分。梗阻性黃疸(obstructivejaundice，OJ)時(shí)高膽酸(鹽)血癥會(huì)引發(fā)腸道細(xì)菌移位和內(nèi)毒素血癥，后者又可進(jìn)一步誘導(dǎo)機(jī)體免疫功能障礙、胃腸道黏膜損傷、凝血機(jī)制紊亂甚至急性腎功能衰竭，從而形成惡性循環(huán)，病死率亦居高不下。臨床上亦有部分重度OJ患者即使在膽道梗阻解除后黃疸消退仍緩慢甚或發(fā)生嚴(yán)重并發(fā)癥。因此深入研究膽道梗阻及再通后病理生理改變的分子機(jī)制

2、，對(duì)臨床如何增強(qiáng)長(zhǎng)期重度OJ患者的手術(shù)耐受性、提高手術(shù)安全性、促進(jìn)術(shù)后的恢復(fù)具有重要意義。 近年來(lái)，具有肝組織特異性的膽鹽轉(zhuǎn)運(yùn)子越來(lái)越受到人們的關(guān)注。鈉-?；悄懰猁}共轉(zhuǎn)運(yùn)多肽(Na+-taurocholatecotransportingpolypeptide，Ntcp)和膽鹽輸出泵(bilesaltexportpump，Bsep)是分別位于肝細(xì)胞膜血竇面和毛細(xì)膽管面上介導(dǎo)膽酸(鹽)依賴ATP進(jìn)行代謝的膜糖蛋白，兩者的表達(dá)和/或功

3、能異常是導(dǎo)致各種膽汁淤積癥的根本因素。我們?cè)芯孔C實(shí)重組人生長(zhǎng)激素(recombinanthumangrowthhormone，rhGH)能明顯促進(jìn)大鼠肝細(xì)胞對(duì)膽紅素的代謝，但其對(duì)膽鹽轉(zhuǎn)運(yùn)的影響如何尚不清楚。 生長(zhǎng)激素與生長(zhǎng)激素受體(growthhormonereceptor，GHR)結(jié)合引起信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子5(signaltransducerandactivatoroftranscription5，STAT5)徑路活化是

4、GH發(fā)揮效應(yīng)的最主要途徑。肝臟是人體內(nèi)GHR含量最多的器官，既往在對(duì)OJ大鼠肝再生與GH/GHR軸關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)，OJ大鼠存在GH分泌不足和GHR表達(dá)下降，相應(yīng)的Stat5活性下調(diào)。我們推測(cè)，外源性補(bǔ)充rhGH能通過(guò)上調(diào)肝細(xì)胞胞漿內(nèi)Stat5活性，后者移位至細(xì)胞核內(nèi)與靶序列結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控Ntcp和Bsep基因表達(dá)，起到促進(jìn)膽鹽代謝的效應(yīng)。 目的： 本研究擬通過(guò)建立膽道梗阻-再通大鼠模型，觀察Ntcp和Bsep在膽道梗阻

5、.再通大鼠肝組織中的表達(dá)變化，以及rhGH對(duì)Ntcp和Bsep表達(dá)的影響，結(jié)合肝組織Stat5表達(dá)水平及功能活性，探討GH/GHR-Stat5徑路調(diào)控膽酸(鹽)代謝的分子機(jī)制，為臨床上防治梗阻性黃疸及其嚴(yán)重并發(fā)癥、促進(jìn)術(shù)后恢復(fù)提供新的思路。 方法與結(jié)果： 1、重組人生長(zhǎng)激素在膽道梗阻-再通大鼠中的應(yīng)用價(jià)值：大鼠被隨機(jī)分為A組(假手術(shù)組)、B組(膽道梗阻-再通-NaCl注射組)及C組(膽道梗阻-再通-rhGH注射組)，B組

6、術(shù)后14d大鼠累積病死率為41.9％(13/31)，與C組14.3％(3/21)相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=4.493，P=0.034)。給予rhGH的c組大鼠血清學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)(ALT、TBIL、TBA和TNF-α)的改善明顯優(yōu)于0.9％NaCl注射的B組，隨用藥天數(shù)的增加，效果更趨明顯，特別是在Pst14d時(shí)ALT和TNF-α水平已回落至A組水平，并顯著低于B組(P＜0.05)。應(yīng)用透射電鏡觀察肝組織超微結(jié)構(gòu)改變，結(jié)果顯示C組肝細(xì)胞

7、線粒體腫脹、毛細(xì)膽管擴(kuò)張以及單位面積微絨毛數(shù)量減少均較B組減輕，至Pst14d時(shí)肝細(xì)胞及毛細(xì)膽管形態(tài)恢復(fù)較好，微絨毛數(shù)量明顯增加。 2、膽鹽轉(zhuǎn)運(yùn)子Ntcp和Bsep在膽道梗阻-再通大鼠中的表達(dá)和意義：采用免疫組織化學(xué)、逆轉(zhuǎn)錄PCR及Westernblotting等技術(shù)分別在肝細(xì)胞膜上定位、基因轉(zhuǎn)錄及蛋白翻譯等水平上檢測(cè)Ntcp和Bsep的表達(dá)情況以及rhGH對(duì)Ntcp和Bsep表達(dá)的影響。結(jié)果顯示：CBDL術(shù)后Ntcp與：Bse

8、pmRNA及蛋白表達(dá)即明顯減弱(P＜0.05)，Pst7d降至最低，BDR術(shù)后兩者的表達(dá)緩慢增加，至Pst14d時(shí)仍未恢復(fù)至A組水平(P＜0.05)。各時(shí)相點(diǎn)下C組大鼠肝組織中兩種轉(zhuǎn)運(yùn)子的表達(dá)水平高于B組。 3、rhGH活化Stat5徑路對(duì)膽鹽轉(zhuǎn)運(yùn)子Ntcp和Bsep的調(diào)控機(jī)制研究：采用肝組織切片原位雜交(insituhybridization，ISH)和電泳遷移率變動(dòng)分析(electrophoreticmobilityshif

9、tassay,EMSA)檢測(cè)stat5mRNA表達(dá)水平以及Stat5與靶序列的結(jié)合能力，從不同層面探討Stat5表達(dá)以及功能活性變化的規(guī)律。結(jié)果顯示：膽道梗阻在很大程度上抑制了Stat5的表達(dá)和功能，在該模型中Stat5的轉(zhuǎn)錄水平以及與靶序列結(jié)合活性同樣呈現(xiàn)出先下降再緩慢上升的變化趨勢(shì)，rhGH能部分維護(hù)Stat5徑路的功能活性。 結(jié)論： 1、rhGH的應(yīng)用能增強(qiáng)OJ大鼠進(jìn)行膽道再通手術(shù)的耐受性、提高安全性，并促進(jìn)術(shù)后的

10、恢復(fù)，具有“利膽”和改善肝功能的有益效應(yīng)； 2、膽道梗阻時(shí)Ntcp和Bsep表達(dá)均明顯下調(diào)，膽道再通后緩慢恢復(fù)，尤其是Bsep恢復(fù)得更為緩慢，這可能是重度OJ患者術(shù)后血清膽鹽水平下降遲緩、恢復(fù)不容樂(lè)觀的主要原因之一； 3、rhGH能通過(guò)上調(diào)Ntcp和Bsep表達(dá)，增加肝細(xì)胞對(duì)膽鹽的攝取和排泌，促進(jìn)膽道再通后膽鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)功能的恢復(fù)； 4、膽道梗阻抑制了Stat5的表達(dá)和功能，與梗阻期間GH/GHR軸活性下調(diào)有關(guān)，并